转录因子ERF家族
ERF转录因子研究进展
ERF转录因子研究进展高浩;竺锡武【摘要】ERF(Ethylene-responsive factor)转录因子是AP2/ERF大家族中的一个大的亚家族,仅含1个AP2/ERF结构域,每个成员都含有1个由大约60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域.有研究表明,每种植物有100种以上ERF转录因子,其功能各不相同,分别具有调节植物生长发育、抗生物胁迫和非生物胁迫的作用等.本文就ERF转录因子的研究现状及发展趋势进行分析,以期为ERF转录因子的应用提供参考.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】3页(P130-131,134)【关键词】ERF转录因子;功能;作用机理【作者】高浩;竺锡武【作者单位】湖南人文科技学院,湖南娄底 417000;湖南人文科技学院,湖南娄底417000【正文语种】中文【中图分类】Q943随着环境条件的恶化，植物在生长发育过程中受到的非生物因素和生物因素影响会更多，如高温、低温、干旱、盐碱、病虫害等。
在不断适应环境和进化过程中，植物形成了复杂有效的逆境胁迫应答体系，可以调节植物使其能够适应新的生长环境。
其中，在转录水平的调控过程中转录因子发挥了非常重要的作用[1]。
转录因子又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子[2]。
AP2/ERF家族转录因子对植物非常重要，可以调控植物整个生命周期的生长发育和逆境[3-7]。
根据AP2结构域的数目和结构特点，AP2/ERF家族转录因子可分为4个亚族（ERF、DREB、AP2、RAV）和单独成员（Soloist）[4-5，8]。
ERF（Ethylene-responsive factor）转录因子是 AP2/ERF大家族中的一个大的亚家族，仅含1个AP2/ERF结构域，在结构域序列的第14位和第19位分别是丙氨酸和天冬氨酸。
《黄花苜蓿AP2-ERF家族MfERF014基因调控植物响应非生物胁迫的功能研究》范文
《黄花苜蓿AP2-ERF家族MfERF014基因调控植物响应非生物胁迫的功能研究》篇一黄花苜蓿AP2-ERF家族MfERF014基因调控植物响应非生物胁迫的功能研究摘要：本研究针对黄花苜蓿AP2/ERF家族的MfERF014基因进行了深入的功能研究，探讨了该基因在植物响应非生物胁迫过程中的作用机制。
通过基因克隆、表达模式分析、转基因技术及胁迫处理等手段，揭示了MfERF014基因在提高植物抗逆性方面的潜在应用价值。
一、引言黄花苜蓿作为一种重要的豆科作物，在农业生态系统中具有较高的经济价值和生态价值。
然而，植物在生长过程中常常面临各种非生物胁迫，如干旱、盐渍、低温等，这些环境因素严重影响了作物的产量和品质。
因此，研究植物如何响应非生物胁迫，尤其是从分子层面解析相关基因的功能，对于提高作物的抗逆性具有重要意义。
AP2/ERF家族是一类重要的植物转录因子家族，参与植物对多种生物和非生物胁迫的响应。
其中，MfERF014基因作为黄花苜蓿AP2/ERF家族的一员，其功能尚不明确。
本研究旨在探讨MfERF014基因在植物响应非生物胁迫过程中的功能及作用机制。
二、材料与方法1. 材料选取黄花苜蓿作为实验材料，通过基因克隆技术获取MfERF014基因的序列信息。
2. 方法（1）基因克隆：利用PCR技术扩增MfERF014基因的编码区序列。
（2）表达模式分析：通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析MfERF014基因在不同非生物胁迫条件下的表达模式。
（3）转基因技术：构建MfERF014基因的过表达和沉默载体，通过遗传转化获得转基因黄花苜蓿植株。
（4）胁迫处理：对转基因植株进行干旱、盐渍、低温等非生物胁迫处理，观察并记录植株的生长状况及生理指标变化。
三、结果与分析1. 基因克隆与序列分析成功克隆了MfERF014基因的编码区序列，该基因编码一个含有AP2结构域的转录因子。
2. 表达模式分析qRT-PCR结果显示，MfERF014基因在干旱、盐渍和低温等非生物胁迫条件下表达量显著上调，表明该基因可能参与植物对非生物胁迫的响应。
《花椰菜乙烯受体转录因子(ERF)的克隆及其在逆境应答中的功能研究》
《花椰菜乙烯受体转录因子（ERF）的克隆及其在逆境应答中的功能研究》摘要：本文旨在研究花椰菜乙烯受体转录因子（ERF）的克隆过程，并探讨其在逆境应答中的功能。
通过分子生物学技术，成功克隆了花椰菜ERF基因，并对其表达模式进行了分析。
研究结果表明，该基因在逆境条件下具有重要调控作用，对植物抗逆性具有潜在的应用价值。
一、引言乙烯是植物生长和发育过程中的重要激素之一，其信号转导途径在植物逆境应答中发挥着关键作用。
乙烯受体转录因子（ERF）作为乙烯信号转导途径的关键组成部分，在植物应对环境胁迫时起着重要的调控作用。
因此，研究花椰菜乙烯受体转录因子（ERF）的克隆及其在逆境应答中的功能具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料准备实验所用材料为花椰菜组织，实验中所用的引物、试剂等均为市售高品质产品。
2. 方法（1）基因克隆：采用PCR技术，以花椰菜基因组DNA为模板，扩增ERF基因。
（2）序列分析：对克隆得到的ERF基因进行序列分析，确定其编码序列及结构特征。
（3）表达分析：采用实时荧光定量PCR技术，分析ERF基因在花椰菜不同组织及逆境条件下的表达模式。
（4）功能研究：通过转基因技术，研究ERF基因在植物逆境应答中的功能。
三、实验结果1. 基因克隆与序列分析通过PCR技术成功克隆了花椰菜ERF基因，序列分析表明该基因编码一个含有AP2结构域的转录因子。
该基因具有典型的ERF家族特征，表明其可能参与乙烯信号转导途径。
2. 表达分析实时荧光定量PCR结果显示，ERF基因在花椰菜不同组织中均有表达，且在逆境条件下表达量明显上升。
其中，在受到病原菌侵染、干旱、高温等逆境条件时，ERF基因的表达量显著增加。
3. 功能研究通过转基因技术，研究了ERF基因在植物逆境应答中的功能。
结果表明，过表达ERF基因的植物在逆境条件下的抗性明显增强，表现出更强的生长恢复能力和抗病能力。
这表明ERF基因在植物逆境应答中具有重要调控作用。
ERF植物转录因子与植物抗逆研究
酵母单杂交方法—体内分析转录因子与DNA结合特性或转录激活活性
（3）同源克隆 同源克隆的优点是在植物材料的基因信息未知的情况下，通过已知
（3）泛素介导的蛋白降解途径是翻译后调控转录因子蛋 白水平的另一个机制。
4、转录因子研究方法
4.1 克隆转录因子的方法
基于转录因子具有表达丰度低、与顺式元件特异性结合且DNA结合序 列保守等特点。目前，分离克隆转录因子常用的方法主要有以下几种：
（1）转座子标签法与RNA差异显示法 相结合的克隆方法
1、转录因子的结构特征
转录因子的三维结构中，N端通常含有与顺式作用元件 相结合的关键结构域。在转录调控过程中，转录因子通过 其 DNA结合域与靶序列特异结合，来实现对靶基因的精确 调控。
转录因子一般由4个功能区域组成： DNA结合区(DNA binding domain) 转录调控区(Transcription regulation domain)
（5）规模化分离、鉴定转录因子超家族成员 随着基因组测序技术的迅猛发展，多种植物的基因组已经测序完毕。
因此，利用生物信息学方法从全基因内分离、鉴定家族基因已成为研究 热点。这有助于全面系统深入解析基因的功能，在拟南芥、水稻、大豆 及其他一些作物的基因组中系统分析AP2/ERF家族基因已有报道。
总之，上述五种克隆转录因子的方法并不是孤立的, 需要结合实 验材料、实验目的等实际情况，综合采用上述一种或多种方法克隆目 的基因。
ERF植物转录因子研究与植物抗逆
转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非 常重要的角色。在植物抗逆反应过程中，当植物受到外界环境 胁迫后，植物通过其信号传导途径有效地调控体内相关功能基 因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，形成高效有序的 信号调控网络，以降低或消除给植株带来的危害。
ERF转录因子
一、乙烯信号转导通路乙烯是一种非常重要的植物激素。
乙烯在植物生长发育和适应生物和非生物胁迫反应中起到了非常重要的作用。
种子萌发、开花、叶片衰老、果实成熟、根瘤、细胞程序性死亡以及对非生物胁迫和病原体入侵的反应等生理过程都与乙烯密切相关。
乙烯信号转导通路的最上游是位于内质网膜上的5个乙烯受体，分别被称为：ETR1、ETR2、ERS1、ERS2和EIN4。
位于乙烯受体下游的是一个负调节因子，蛋白激酶CTR1。
CTR1蛋白激酶通过与乙烯受体相结合定位在内质网上。
在没有乙烯存在的条件下，CTR1和受体的结合会协同抑制下游乙烯信号途径。
在CTR1负调控因子下游是一个正调控因子EIN2。
EIN2基因发生功能缺失突变会产生乙烯不敏感表型，显示出EIN2在乙烯信号通路中起到了核心作用。
EIN2的半衰期很短，两个F-Box蛋白ETP1和ETP2负责调控EIN2的泛素化降解。
位于EIN2下游的是正调控的转录因子家族EIN3及5个EILs。
研究发现，他们同样是受泛素化途径降解的，负责调控EIN3及EILs泛素化降解的F-Box蛋白是EBF1和EBF2。
EBF5是一种外切核酸酶它能够通过促进EBF1和EBF2的mRNA的降解来拮抗这两个蛋白对EIN3的负反馈调控。
EIN3和EIL1通过启动乙烯信号转导途径示意图转录级联反应来激活下游乙烯响应基因的表达。
二、乙烯响应因子（ethylene response factor、ERF）的结构特点及生物信息学分析ERF基因家族是一个很大的转录因子家族，属于AP2/ERF转录因子超家族。
Ohme-Takagi和Shinshi研究发现，GCC box是植物乙烯响应的DNA序列元件；同时他们在烟草（Nicotiana tabacuum）中发现了能特异性结合GCC box元件的数个乙烯响应元件结合蛋白（EREBPs），并发现，EREBPs同GCC元件相结合的结构域是59个保守的氨基酸残基。
转录因子在植物抗逆性中的调控机制
转录因子在植物抗逆性中的调控机制转录因子在植物抗逆性中的调控机制是一个复杂而精细的生物学过程。
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一、转录因子概述转录因子是一类能够结合到DNA上的蛋白质，调控基因的转录过程。
在植物中，转录因子对抗逆性基因的表达起着至关重要的作用。
植物在面临逆境如干旱、盐碱、低温、高温、病原菌侵染等环境压力时，转录因子能够通过调节下游基因的表达，增强植物的适应性和生存能力。
1.1 转录因子的功能转录因子通过识别特定的DNA序列，与基因的启动子区域结合，从而激活或抑制基因的转录。
它们可以是激活因子，促进基因表达；也可以是抑制因子，抑制基因表达。
转录因子的活性受到多种信号通路的调控，包括植物激素信号、环境信号和内部代谢信号等。
1.2 转录因子的分类转录因子可以根据其结构域和功能进行分类。
常见的转录因子家族包括AP2/ERF家族、bZIP家族、WRKY家族、MYB 家族等。
每个家族的转录因子都有其特定的DNA结合模式和调控特性。
二、转录因子在植物抗逆性中的调控机制植物在逆境条件下，转录因子通过多种机制调控基因表达，以应对不同的环境压力。
2.1 逆境信号的识别与响应植物首先需要识别逆境信号，如干旱、盐分、低温等。
这些信号通过植物的感知系统被识别后，会激活一系列的信号传导途径，最终导致转录因子的激活或抑制。
2.2 转录因子的激活与功能逆境信号激活的转录因子会进入细胞核，结合到特定基因的启动子区域，调控这些基因的表达。
这些基因通常编码与抗逆性相关的蛋白质，如渗透调节蛋白、抗氧化酶、抗冻蛋白等。
2.3 转录因子的相互作用转录因子之间也存在相互作用，它们可以通过形成同源或异源二聚体，或者通过相互竞争DNA结合位点，来协同调控基因表达。
这种相互作用增加了调控网络的复杂性，使得植物能够精细调控其抗逆性反应。
2.4 转录因子的后转录调控除了直接调控基因的转录，转录因子还可以通过影响mRNA的加工、稳定性和翻译等后转录过程，进一步调节基因表达。
ERF类转录因子的结构与功能
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｅ Ｅ ｒ ｎ ｃ ｐ ｉｎ ｆｃｏ ｓ ａｅ ｋ ｏ ｏ ｂ ｎ ｑ ｅ ｉ ｌｎ ｓ Ｔ ｅ ｍｅ ｅ ｓｏ ｉ ｆｍｉ ａ ｅ ａＣｏ ｓ ｒ ｃ ： ｈ ＲＦ ｔ ｓ ｒ ｔ ａ ｔｒ ｒ ｎ ｗｎ ｔ ｅ ｕ ｉ ｕ ｎ ｐ ａ ｔ ｈ ｍｂ ｒ ｆｔ ｓ ａ ｌ ｈ ｖ ｍｍｏ ｅ — ａ ｉ ｏ ｈ ｙ ｎ ｌａ
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珙桐AP2
2024 年 3月第 61 卷第 2 期Mar. 2024Vol. 61 No. 2四川大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University （Natural Science Edition）珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定曾沥，孙曼丽，刘晋芸，胡小盼，魏炜（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610065）摘要: 为探究AP2/ERF类转录因子在珙桐开花调控及花器官发育中的作用，本研究通过从实验室珙桐不同发育时期苞片和叶片的转录组数据中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2/ERF家族基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1，经过生物信息学分析、基因克隆及功能鉴定初步研究了目的基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制.亚细胞定位实验显示DiAP2-1主要定位于细胞质，DiDREB-1和DiRAV-1主要定位于细胞核.对目的基因在珙桐中的表达模式分析发现DiAP2-1和DiRAV-1在苞片发育过程中表达量逐渐降低，DiDREB-1只在苞片第三时期高表达，推测DiDREB-1、DiRAV-1属于A类基因，DiAP2-1属于B类基因.表型实验显示DiDREB-1和DiRAV-1转基因拟南芥株系较野生型表现为明显的早花，DiAP2-1同源基因对应的拟南芥突变体与同一时期野生型拟南芥对比表现为花瓣减少且萼片大，角果呈短粗状且败育.对关键开花调控基因表达模式分析发现DiDREB-1和DiRAV-1异源表达后使其他促花因子表达量上调进而使拟南芥花期提前.以上结果表明，AP2/ERF类转录因子DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1在珙桐苞片及花器官发育和珙桐开花调控中发挥了重要作用.关键词: 珙桐；花器官；苞片； AP2/ERF中图分类号: Q37 文献标志码: A DOI:10.19907/j.0490-6756.2024.026002Cloning and functional identification of AP2/ERF family-relatedgenes in Davidia involucrata Baill.ZENG Li， SUN Man-Li， LIU Jin-Yun， HU Xiao-Pan， WEI Wei（Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences，Sichuan University， Chengdu 610065， China）Abstract: To investigate the role of AP2/ERF transcription factors in the regulation of Dove tree flowering and floral organ development， this study was conducted to screen the AP2/ERF family genes DiAP2-1， Di⁃DREB-1and DiRAV-1from the transcriptomic data of dove bracts and leaves at different developmental stages in the laboratory.A preliminary study of the regulatory mechanisms of these genes in the development of dove bracts was conducted by bioinformatics analysis， gene cloning and functional characterization.Subcel‑lular localization experiments showed that DiDREB-1and DiRAV-1 were expressed in the nucleus， except for DiAP2-1， which was mainly expressed in the cytoplasm.Analysis of the expression pattern of the target genes in dove showed that the expression levels of DiAP2-1 and DiRAV-1 gradually decreased during bract development，while DiDREB-1was only highly expressed during the third bract period，presumably Di⁃DREB-1 and DiRAV-1belonged to class A genes and DiAP2-1 belonged to class B genes.Phenotypic ex‑收稿日期: 2023-03-24基金项目: 四川省科技厅育种攻关项目(2021YJ0296)作者简介: 曾沥（1997-），男，四川南充人，硕士研究生，主要从事珙桐基因的功能研究.E-mail: 310953866@通讯作者: 魏炜.E-mail: weiwscu@第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期periments showed that DiDREB-1 and DiRAV-1 transgenic Arabidopsis strains exhibited early flowering compared to the wild type， and the Arabidopsis mutant corresponding to the DiAP2-1 homologue showed re‑duced petals and larger sepals，and short，stubby and failure to breed hornbeam compared to the wild type Arabidopsis at the same time.These results suggest that the AP2/ERF-like transcription factors DiAP2-1，DiDREB-1 and DiRAV-1 play key roles in the development of dove bracts and flowering organs and in the regulation of Dove tree flowering.Keywords: Dove tree； Flowering organ； Bract； AP2/ERF1 引言珙桐（Davidia involucrata Baill.）第三纪古热带孑遗树种，为中国特有的单属植物［1］，1999年被列为国家首批一级重点保护野生植物，有植物大熊猫和活化石之称［2， 3］.而珙桐独特的形似飞翔鸽子的一对苞片（实质是一种变态叶）是珙桐最引人入胜的地方［4］，也是其成为重要观赏植株并得名鸽子树的原因.花器官是植物生长繁殖过程中重要的组织器官之一，对植物种群规模的维持及扩大尤为重要［5］.花器官的发育可大致分为以下几个阶段：首先是开花诱导阶段，它是花发育过程中尤为重要的关键步骤，决定着植物是否开花以及何时开花；其次是花的发端阶段，植物通过整合不同途径通路信号激活花分生组织特征基因，进而实现对花器官特征基因的激活；最后是花器官发育阶段，主要由部分花器官特征基因对负责花器官形态发育的部分特征基因进行激活，进而实现花器官正常发育过程［6， 7］.植物AP2/ERF是一个具有众多成员的庞大转录因子基因家族，此类转录因子都含此家族特殊的结构域，如AP2结构域或B3结构域.根据结构域的数量和识别序列的不同可以将其分为5个亚家族，存在于几乎所有的植物中且参与多种生物学过程［8］.已有研究表明AP2类基因在拟南芥花器官特性的形成和花同源异型基因表达的调控中发挥着核心作用，并发现其在花的四种器官萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有表达［9］.也有研究表明，属于拟南芥RAV亚家族成员的TEM1和TEM2受多个开花通路的基因调控［10］.AP2/ERF 家族不仅参与调节植物生长发育尤其是花器官的发育，而且在响应外界胁迫中也发挥重要作用.现阶段AP2/ERF转录因子作为重要的抗性调控基因在基因工程或作物育种中越来越受到重视［11］，也为将来创造出兼具高产、抗病及富含营养等优良性状农作物品种提供资料［12］.在对植物开花途径的研究中发现，植物正常开花主要受到以下开花诱导途径的影响，其中主要包括光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主促进途径［13］.各种开花诱导途径在独立发挥作用的同时，也共同构成了一个复杂而精密的调控网络，共同调控着整个开花过程.而花器官的发育也有着极为复杂的调控过程，在对花器官发育调控网络研究过程中逐步确立了花发育“ABCDE”模型［14-16］.并在该模型基础上又提出四因子发育模型［17］.但是随着对植物花器官发育研究的深入，发现除花发育“ABCDE”模型包含的相关功能基因外，还存在很多模型外基因在花发育过程中也发挥着重要作用，对花器官形态构建有着重要影响.例如，在矮牵牛中AGL6亚家族基因PhAGL6具有着与E类功能基因类似的功能，对矮牵牛花药及花瓣的发育产生影响，与其内部E类功能基因存在部分程度上的功能冗余.这类基因不仅存在于MADS-box基因家族中，其他基因家族中的部分基因同样在植物花发育过程中发挥着独特作用，并参与到植物花器官正常发育过程当中［18］.本研究在珙桐叶片以及苞片不同发育时期的转录组数据中筛选出部分在珙桐叶片和苞片差异表达的AP2/ERF家族基因，进行生物信息学分析、相关基因的克隆、鉴定、亚细胞定位及目的基因在珙桐中的时空表达模式分析，结合目的基因异源表达进行拟南芥遗传转化，对筛选出的基因的功能进行初步鉴定及探究.初步阐明此类转录因子在珙桐花发育过程中的作用，以期为进一步解析珙桐苞片发育的分子调控机制奠定基础.2 材料与方法2.1 材料在四川省都江堰市虹口乡龙溪虹口国家级自然保护区内采集野生珙桐不同发育时期苞片、叶片、叶芽、根、枝条等组织；本氏烟草（Nicotiana第 2 期曾沥，等：珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷benthamiana）种子由本课题组保存并提供，于课题组现有温室内种植培养，培养条件：室温23 ℃，空气湿度55%，光周期为光照16 h黑暗8 h交替，光照强度为120 μmol∙m-2∙s-1；哥伦比亚型拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子由本课题组保存并提供，突变体（拟南芥突变体（CS148、SALK_ 083090、CS313884）采购于ABRC；过表达拟南芥植株：构建过表达重组载体，通过农杆菌介导法获得过表达目的基因拟南芥植株，所用转基因植株均为筛选至 T3 代的纯合系.2.2 方法2.2.1 目的基因的确定及克隆 利用实验室自建的珙桐全转录组数据，通过结构域分析、表达模式分析及差异聚类分析等，最终从中筛选出了可能与珙桐苞片发育相关的分别来自三个不同亚家族的三个基因.以珙桐总cDNA为模板通过常规PCR扩增获得DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1的目的基因片段.2.2.2 载体构建 为构建亚细胞定位载体，将目的基因与pBI221-EGFP表达载体构建融合载体；为构建过表达载体，将目的基因与pBI121-EGFP 表达载体构建融合载体.2.2.3 目的基因在珙桐中的时空表达分析 以珙桐β-Diactin为内参基因，采用qRT-PCR实验方法，对DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1在珙桐不同发育时期不同组织内的表达情况进行检测，数据结果由三次独立重复实验提供，使用的引物见表1.2.2.4 亚细胞定位分析 将构建的亚细胞定位载体通过PEG-Calcium介导转入烟草原生质体中表达，在正置荧光显微镜下观察DiAP2-1、Di⁃DREB-1和DiRAV-1的亚细胞定位.2.2.5 纯合转基因株系表型分析 将野生型、ap2突变体、DiAP2-1、DiDREB-1、DiRAV-1转基因株系（每个株系均种植10株）正常培养，对各拟南芥株系的表型进行观察，测定相关生理指标并统计相关数据.2.2.6 转基因植株中开花调控关键基因表达分析 为探究异源表达DiAP2‑1、DiDREB-1和DiRAV‑1是否影响到开花的关键基因表达量，我们挑选6个参与拟南芥开花调控的关键基因：AtSPL、AtAP1、AtAGL24、AtLFC、AtFT和AtLFY，利用qRT-PCR进行基因相对表达量检测，野生型作为对照组，β-actin为内参基因，使用的引物见表2.3 结果与分析3.1 目的基因的确定及克隆从自建的珙桐全转录组数据筛选出三个AP2/ERF家族目的基因，分别为AP2亚家族的CL18617.Contig3_All、DREB亚家族的CL16625. Contig4_All以及RAV亚家族的CL4058.Con‑tig1_All，并命名为DiAP2‑1、DiDREB‑1和Di⁃RAV‑1.PCR扩增获得目的基因片段与转录组数据比对见图 1.3.2 DiAP1、DiTFL1s在珙桐中的时空表达分析利用qRT-RCR技术，分析珙桐DiAP2‑1、Di⁃DREB‑1、DiRAV‑1三个基因在叶片苞片不同时期和不同组织中相对表达量，以叶片第一时期L1的表达量为对照，以珙桐β-actin为内参基因.表1 珙桐荧光定量所用引物Tab.1 Primer sequence used in qRT-PCR of D.involu⁃crata Baill.引物名称q-DiAP2-1q-DiDREB-1q-DiRAV-1 DiActin引物序列（5′→3′）F：GACATGGCAGCTATAGAGTACCR：GTCAACATTAGGGTTAGGGF：CGAGATAGTAGAGTTGCCGAGTCTGR：CTGCTCGAAATCGCACTCTCGGF：CCGGTTCAGATGGTTAGACR：GTTACAAAGCTCCAATGGCCF：GGTCGTACAACTGGTATTR：GAGCATAGCCTTCATAGAT表2 拟南芥荧光定量所用引物Tab.2 Primer sequence used in qRT-PCR of A.thaliana引物名称q-AtAP1q-AtAGL24q-AtLFCq-AtFTq-AtSPL-q-AtLFYβ-AtActin引物序列（5′→3′）F：AAGAGGATAGAGAACAAGR：AAGAATCAGTGGAGTATTF：ATGGCGAGAGAGAAGATAAGGR：CCTTCCCAATATGTCTCTCF：CGATAACCTGGTCAAGATR：CTATCCACAAGTTCAAGTAGF：CTACAACTGGAACAACCTTR：AACACGACACGATGAATTF：CCAATAATCGCTGTGACACR：AACCTTGGCTCCTCTGATF：TTATCTGTTCCACTTGTAR：TTTAGGCTTGTTTATGTAAF：CTAATCGTGAGAAGATGACTR：AAGAACAGCCTGAATAGC第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期qRT -RCR 结果如图2，结果发现DiAP 2-1和DiRAV -1这两个基因荧光定量结果大概一致，都在叶片和苞片中表达模式差异大，在叶片三个发育时期先下降后升高，而苞片三个发育时期中则表达量逐渐降低，且苞片中的表达量相比叶片较低.DiDREB -1表达模式却不同，DiDREB -1主要在叶片第一时期高表达，在苞片第三时期高表达，DiDREB -1基因在珙桐叶片和苞片发育过程中表达模式也具有差异性.DiAP 2-1和DiDREB -1主要与苞片第二时期到第三时期发育或苞片由淡绿色转变为乳白色变化有关.在同一时期珙桐不同组织包括第三时期叶片、苞片、根、茎、雄蕊、雌蕊、萼片、芽八个组织中的表达模式分析.如图3可知，DiAP 2-1在苞片、雄雌蕊中表达较高，在根、茎和萼片中几乎不表达；DiDREB -1在雌蕊、萼片和芽中高表达，根、茎和雄蕊几乎不表达；DiRAV -1在萼片和芽中表达较高，只有茎和雄蕊几乎不表达.图1 珙桐目的基因克隆序列比对图Fig.1 Sequence alignment of D.involucrataBaill.图2 珙桐目的基因在叶片和苞片中不同时期的表达情况L1-L3分别指叶片第一时期至叶片第三时期；B1-B3分别指苞片第一时期至苞片第三时期Fig.2 Expression of genes in leaves and bracts of D.involucrata Baill.at different stagesL1-L3 refer to leaf first period to leaf third period ； B1-B3 refer to bract first period to bract third period第 2 期曾沥，等： 珙桐AP2/ERF 家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷3.3 亚细胞定位试验将表达载体（由已去除终止密码子的DiAP 2-1、DiDREB -1、DiRAV -1核苷酸序列与pBI 221-EGFP 载体共同构建）转化至当天制备的高质量烟草原生质体中，暗培养后的烟草原生质体通过正置荧光显微镜观察拍照，结果如图 4所示.烟草瞬时转化亚细胞定位实验结果发现，绿色荧光信号显示除了DiAP2-1主要在细胞质中表达以外，Di⁃DREB -1、DiRAV -1都在细胞核中表达.3.4 纯合转基因株系表型分析将野生型、ap 2突变体、DiAP 2-1、DiDREB -1和DiRAV -1转基因株系（每个株系均种植10株）正常培养，对各拟南芥株系的表型进行观察，测定相关生理指标并统计相关数据.对比同一时期的转基因植株、野生型与对应功能突变体的表型见图5和图6.结果表明：DiAP 2-1转基因植株和野生型比图3 珙桐目的基因在不同组织的表达情况L3指叶片第三时期；B3指苞片第三时期Fig.3 Expression of genes in different tissues of D.involucrate Baill at different stagesL3 refer to leaf third period ；B3 refer to bract third period图4 珙桐目标基因亚细胞定位结果GFP ，GFP 荧光；BF ，明场；Merged ，合并图像Fig.4 Subcellular localization of target genes of D.involucrata Baill.GFP ， GFP fluorescence ； BF ， bright -field ； Merged ， merged image第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期较，不论在花期、株高还是微观的花器官中都无明显的区别，如图 6a.而AP2-1对应功能缺失突变体与野生型相比发现有明显的表型差异如图6a，具体表现为花期提前，花瓣减少且花瓣变小，萼片变大，花的形态发生在第1轮和第4轮受到影响，在第2轮没有器官形成，第3轮大部分空置，角果呈短粗状且败育如图6b.DiDREB-1和DiRAV-1两个基因的转基因植株开花时间明显早于野生型植株如图5，而后期株高无明显差异.DiDREB-1和DiRAV-1这两个基因对应的同源拟南芥突变体，只有后期表现为株高比野生型高，其他表型无明显区别如图6c和6d.莲座叶统计实验所用株系为WT、DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1异源表达纯合植株.当各株系拟南芥主花序约生长到4~5 cm时，统计拟南芥的莲座叶数目如图7，各株系均统计10株.WT植株开花时的莲座叶平均数为11.9；DiAP2-1异源表达株系开花时的莲座叶平均数为11.6；而DiDREB-1和DiRAV-1异源表达拟南芥株系开花时的莲座叶统计平均数为9.1和9.4，显著少于野生型植株，进一步表明在拟南芥中异源表达DiDREB-1和DiRAV-1可以使植株提前开花，而DiAP2-1异源表达植株与WT植株没有显著差异.图5 目的基因异源表达拟南芥植株早花现象Fig.5 Early flowering of A.thaliana plants with heterolo‑gous expression of target genes图6 突变体、野生型及转基因拟南芥表型Fig.6 Mutant，wild type and transgenic Arabidopsis phe‑notype图7 各拟南芥株系莲座叶数目“*”代表显著性差异（P<0.05），代表目的基因与野生型具有显著性差异Fig.7 The number of rosette leaves“*” represents significantly different（P<0.05）， represents thatthe target genes was significantly different from WT图8 转基因拟南芥中关键调控开花基因的表达情况“*”代表显著性差异（P<0.05），代表目的基因与野生型具有显著性差异Fig.8 Expression of key regulatory flowering genes intransgenic Arabidopsis thaliana“*” represents significantly different（P<0.05）， represents thatthe target genes was significantly different from WT第 2 期曾沥，等：珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷3.5 转基因植株中开花调控关键基因表达分析转基因植株中开花调控关键基因表达分析实验结果发现每个株系中6个调控拟南芥开花关键基因的表达模式相似，如图8所示，除了AtAGL24这一个基因以外，其他促花因子的表达量相比野生型都上调.其中异源表达DiAP2-1后，拟南芥AtSPL基因表达水平显著上调并且表达量都高于其他株系，根据开花年龄途径预测该转基因植株表型为晚花，实际却和野生型无区别，所以推测异源AP2类基因可能引起了某一正调控途径使得拟南芥AtSPL基因的表达量上调而表现出晚花现象不明显.这也进一步证明了异源表达DiEDRB-1和DiRAV-1基因可能会影响其他促花因子的表达量上调使得拟南芥表现为花期提前.4 讨论珙桐作为第三纪孑遗植物，同时也是世界著名观赏植物，因其独特的花器官形态而闻名.对于这样一个古老的物种，研究其独特花器官的形成原因，及其花器官对物种生长繁殖的影响是非常有必要的.AP2/ERF家族转录因子可以广泛参与植物次生代谢、花器官发育、植物激素应答和胁迫响应等多种生命活动.对所筛选出的三个来自三个不同亚家族的基因：DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1.克隆后三个目的基因的序列与转录组数据序列比对正确.为了探究各个目的基因在细胞中的表达位置.为了探究DiAP2-1、DiDREB-1、DiRAV-1的蛋白在细胞中的亚细胞定位的情况，我们构建了pBI221-DiAP2/ERFs-EGFP表达载体，然后通过PEG-Calcium介导转入烟草原生质体中观察荧光.结果发现除了DiAP2-1的蛋白主要定位在细胞质以外，其余两个基因DiDREB-1、DiRAV-1均定位于细胞核，这与多数其他转录因子亚细胞定位研究中的结果一致［19］，另外此结果也表明了不是所有AP2/ERF转录因子家族都定位在细胞核，也有研究中发现拟南芥其他家族的某些转录因子定位于细胞质［20］.将可能参与珙桐苞片发育的三个目的基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1通过花序浸染法获取了拟南芥稳定转化植株.通过对这三个基因在珙桐中的表达模式分析，结合各目的基因的稳定转化植株、对应的功能缺失突变体和野生型植株三者进行表型对比观察，再结合表型现象分析异源表达目的基因对拟南芥调控开花关键基因表达量的变化，验证各目的基因的功能.结果表明：DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1三个基因在苞片和叶片中的时空表达和组织特异性表达的相关水平差异都很大；首先是组织特异性表达，在不同组织中，各目的基因主要在花器官中表达而根和茎等其他组织中几乎不表达；表型观察中发现异源表达DiDREB-1和DiRAV-1使拟南芥出现早花现像；对应功能缺失突变体表型观察发现拟南芥缺失AP2基因严重影响了花瓣、萼片以及角果的形态发育；转基因株系中拟南芥花发育相关调控基因的表达水平变化显示，异源表达DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1会引起一部分拟南芥促花因子的表达量上调，但在DiAP2-1异源表达植株中AtSPL的表达量显著上调.三个基因主要在花器官中表达，存在组织器官特异性，根据植物花发育ABCDE模型推测出DiDREB-1、DiRAV-1可能属于A类基因，DiAP2-1属于B类基因，因为植物花发育的ABCDE模型还不能解释所有种类植物的花发育类型，内容仍需进一步完善和不断修正，而且珙桐具有独特的花器官且无花瓣，所以本结果只是在原本植物花发育ABCDE模型基础上的一种推测，后续需要进一步证实.结合表型再通过对拟南芥其他已知关键调控基因表达模式的分析，发现DiDREB-1和DiRAV2-1这两个基因异源表达后确实使其他促花因子表达量有一定的上调进而使拟南芥花期提前.SPL和AP2基因都是参与植物花发育年龄途径的重要成员［21］，本来预测DiAP2-1的异源表达有一定程度的抑制开花［22］，但分析结果后推测可能存在某一正调控途径使得开花促进因子AtSPL表达量上调，最终表型和野生型拟南芥没有区别.研究表明在拟南芥过表达AP2亚家族的ANT和AIL6基因时，拟南芥花的发育受到严重影响，过表达植株的花丝和萼片相较于野生型明显膨大，深入研究发现ANT和AIL6基因可以参与调控生长素的运输［23］.在本章结果中也观察到AP2基因对应功能缺失突变体花瓣减少且花瓣变小，萼片变大，并结合表达模式分析DiAP2-1主要在珙桐花器官中表达且在苞片第二时期到第三时期发育过程中表达量差异最大，所以推测该基因在珙桐苞片发育过程中也有与ANT和AIL6基因类第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期似的调控模式并参与珙桐的花期调控和苞片发育等.最近的研究表明异源表达非AP2/ERF家族基因，如异源表达文心兰OnGI基因促进拟南芥开花［24］，异源表达牡丹PsSPL基因通过促进LFY基因的表达使转基因拟南芥花期提前，且早期的根长和后期株高都有改变［25］.本研究中DiAP2-1转基因拟南芥中暂未观察到花器官的改变但能使AtSPL基因显著上调从而调控花期，这可能与异源表达的基因同源性等问题有关，后续还需要借助其他模式植物进一步探究.本研究发现异源表达珙桐DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1引起其他拟南芥关键调控开花基因表达的变化从而调控花期，结合珙桐中的表达模式分析等推测这三个基因都与珙桐苞片发育密切相关，后续还需要更深入的研究进一步证明或阐明在苞片发育中的具体途径.综上所述，本研究认为AP2/ERF基因家族的目的基因在珙桐开花时间调控、花器官的发育过程中具有重要作用，丰富了现有的关于珙桐花发育的理论知识，为未来珙桐的保护和研究提供了理论依据参考文献:［1］Tang X J.Characteristics and value of Dove trees ［J］.Southwest Horticult， 2002（3）： 54.［唐晓军.珙桐的特性与价值［J］.西南园艺， 2002（3）： 54.］［2］He J S， Lin J， Chen W L.The current status of endemic and endangered species Davidia involucrata and thepreserving strategies ［J］.Biodiv Sci， 1995（4）： 213.［贺金生，林洁，陈伟烈.我国珍稀特有植物珙桐的现状及其保护［J］.生物多样性， 1995（4）： 213.］［3］Yu Y T，Xu G B，Wang X P.Literature review of researches on Davidia involucrate Baill ［J］.Non-WoodForest Res， 2006（4）： 92.［禹玉婷，徐刚标，汪晓萍.珙桐研究进展［J］.经济林研究， 2006（4）： 92.］［4］Feng C M，Liu X，Yu Y，et 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Arabidopsis thaliana ERF FamilylERF Family Introduction lDownload Sequences lMultiple Sequences Alignment lPhylogenetic TreePlant Transcription Factor Databasev3.0Center for Bioinformatics , Peking University , ChinaPrevious versions:v1.0v2.0Home | Blast | Search | Download | Prediction | Help | About |LinksLFY)Species TF IDDescription AT1G01250.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT1G03800.1ERF domain protein 10AT1G04370.1Ethylene-responsive element binding factor 14AT1G06160.1octadecanoid-responsive Arabidopsis AP2/ERF 59AT1G12610.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G12630.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G12890.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G12980.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G15360.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G19210.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G21910.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G22190.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G22810.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G22985.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G24590.1DORNROSCHEN-like AT1G25470.1AP2 domain-containing transcription factor family protein AT1G25470.2AP2 domain-containing transcription factor family protein AT1G28160.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G28360.1ERF domain protein 12AT1G28370.1ERF domain protein 11AT1G33760.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G36060.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G43160.1related to AP2 6AT1G44830.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G46768.1related to AP2 1AT1G49120.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G50640.1ethylene responsive element binding factor 3AT1G53170.1ethylene response factor 8AT1G53910.1related to AP2 12AT1G53910.2related to AP2 12AT1G53910.3related to AP2 12AT1G63030.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G63030.2Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G64380.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G68550.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G68550.2Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G71130.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G71450.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G71520.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G72360.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G72360.2Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G72360.3Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G74930.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G75490.1Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT1G77200.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT1G78080.1related to AP2 4AT1G80580.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G20350.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G20880.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G22200.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G23340.1DREB and EAR motif protein 3AT2G25820.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G31230.1ethylene-responsive element binding factor 15AT2G33710.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G33710.2Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G35700.1ERF family protein 38AT2G36450.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G38340.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G40220.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G40340.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G40350.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G44840.1ethylene-responsive element binding factor 13AT2G44940.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT2G46310.1cytokinin response factor 5AT2G47520.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G11020.1DRE/CRT-binding protein 2BAT3G14230.1related to AP2 2AT3G14230.2related to AP2 2AT3G14230.3related to AP2 2AT3G15210.1ethylene responsive element binding factor 4AT3G16280.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G16770.1ethylene-responsive element binding proteinAT3G20310.1ethylene response factor 7AT3G23220.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G23230.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G23240.1ethylene response factor 1AT3G25890.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G25890.2Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G50260.1cooperatively regulated by ethylene and jasmonate 1AT3G54320.2Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G57600.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G60490.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT3G61630.1cytokinin response factor 6AT4G06746.1related to AP2 9AT4G11140.1cytokinin response factor 1AT4G13040.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G13040.2Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G13040.3Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G13620.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G16750.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G17490.1ethylene responsive element binding factor 6AT4G17500.1ethylene responsive element binding factor 1AT4G18450.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G23750.1cytokinin response factor 2AT4G23750.2cytokinin response factor 2AT4G25470.1C-repeat/DRE binding factor 2AT4G25480.1dehydration response element B1AAT4G25490.1C-repeat/DRE binding factor 1AT4G27950.1cytokinin response factor 4AT4G28140.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G31060.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT4G32800.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinArabidopsis thaliana(139)AT4G34410.1redox responsive transcription factor 1AT4G36900.1related to AP2 10AT4G39780.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G05410.1DRE-binding protein 2AAT5G05410.2DRE-binding protein 2AAT5G07310.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G07580.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G11190.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G11590.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G13330.1related to AP2 6lAT5G13910.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G18450.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G18560.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G19790.1related to AP2 11AT5G21960.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G25190.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G25390.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G25390.2Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G25810.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G43410.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G44210.1erf domain protein 9AT5G47220.1ethylene responsive element binding factor 2AT5G47230.1ethylene responsive element binding factor 5AT5G50080.1ethylene response factor 110AT5G51190.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G51990.1C-repeat-binding factor 4AT5G52020.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G53290.1cytokinin response factor 3AT5G61590.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G61600.1ethylene response factor 104AT5G61890.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G64750.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G65130.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G67000.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G67010.1Integrase-type DNA-binding superfamily proteinAT5G67190.1DREB and EAR motif protein 2ERF Family IntroductionThe AP2/ERF superfamily is defined by the AP2/ERF domain, which consists of about 60 to 70 amino acids and is involved in DNA binding. These three families have been defined as follows. The AP2 family proteins contain two repeated AP2/ERF domains, the ERF family proteins contain a single AP2/ERF domain, and the RAV family proteins contain a B3 domain, which is a DNA-binding domain conserved in other plant-specific transcription factors, in addition to the single AP2/ERF domain.It has been demonstrated that the AP2/ERF proteins have important functions in the transcriptional regulation of a variety of biological processes related to growth and development, as well as various responses to environmental stimuli.After finding the tobacco ERFs, many proteins in the ERF family were identified and implicated in many diverse functions in cellular processes, such as hormonal signal transduction, response to biotic and abiotic stresses, regulation of metabolism, and in developmental processes in various plant species.Toshitsugu Nakano, Kaoru Suzuki, Tatsuhito Fujimura, and Hideaki Shinshi.Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice.Plant Physiol, 2006. 140(2): p. 411-32.PMID: 16407444The first class are proteins which bind to ethylene response elements (ERE) or GCC boxes (tobacco EREBPs, Arabidopsis AtEBP and AtERF1-5, and tomato Pti4-6) found in the promoters of ethylene-inducible pathogenesis related genes. The GCC box is an 11 bp sequence (TAAGAGCCGCC) with a core GCCGCC sequence that is required for binding.The second class includes proteins that bind to the C-repeat or dehydration response element (DRE) in the promoters of genes that are turned on in response to low temperatures and/or water deficit (CBF1, CBF2, CBF3/DREB1A andDREB2A). The C-repeat/DREs contain the core sequence CCGAC.Nole-Wilson S, Krizek BA.DNA binding properties of the Arabidopsis floral development protein AINTEGUMENTA.Nucleic Acids Res. 2000 Nov 1;28(21):4076-82. Erratum in: Nucleic Acids Res 2001 Mar 1;29(5):1261.PMID: 11058102©2010-2013, Center for Bioinformatics, Peking UniversitySupported ByLast Modified: 2013-8-23。