高效液相常见问题及解决
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。
高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。
液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。
1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。
研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。
液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。
当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。
各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。
上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。
既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法 液相色谱常见问题解决方法
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法液相色谱常见问题解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪紧要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统构成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的紧要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，假如在使用过程中不依照正确操作的话，就简单导致一些问题。
其中常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1.柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要紧密注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分别效果及保留时间等紧密相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
压力过高：这是高效液相在使用中常见的问题，指的是压力蓦地上升，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应当分段进行检查。
（1）.首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充分液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，假如液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
假如液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；（2）.打开Purge阀，使流动相不经过柱子，假如压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
假如压力降至100PSI （6.7 Bar）以下，过滤白头正常，在检查；（3）.把色谱柱出口端取下，假如压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：假如是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
假如是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，假如柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很简单造成柱效下降，所以尽量少用。
高效液相色谱常见故障及解决方案
高效液相色谱常见故障及解决方案1.压力过高或过低-压力过高可能是由于柱堵塞或流动阻力增加所致。
解决方案包括更换柱、清洗柱或检查管路是否存在问题。
-压力过低可能是由于泵的磁力搅拌器不工作或进样器封堵所致。
解决方案包括检查泵的磁力搅拌器是否工作正常，清洗进样器。
2.峰形不对称-峰形不对称可能是由于进样量不均匀或柱温度过高所致。
解决方案包括确保进样量均匀和降低柱温度。
3.峰尾或前肩-峰尾可能是由于柱温度过高、流速过快或流动相pH值不合适所致。
解决方案包括降低柱温度、减慢流速或调整pH值。
-前肩可能是由于流动相中存在杂质或柱堵塞所致。
解决方案包括更换流动相或清洗柱。
4.杂峰或基线噪声-杂峰可能是由于样品纯度不高、固定相老化或试剂污染所致。
解决方案包括提高样品纯度、更换固定相或检查试剂是否污染。
-基线噪声可能是由于进样器密封不良、流动相气泡或电噪声所致。
解决方案包括检查进样器密封情况、减少流动相中的气泡或检查电子设备是否存在干扰。
5.柱寿命短-柱寿命短可能是由于样品预处理不彻底、柱收尾不当或流动相pH值不合适所致。
解决方案包括增加样品预处理步骤、正确收尾柱或选择合适的流动相pH值。
6.流量不稳定-流量不稳定可能是由于柱堵塞、进样器密封不良或流动相流速波动所致。
解决方案包括清洗柱、检查进样器密封情况或调整流动相流速稳定性。
7.进样量偏差-进样量偏差可能是由于进样器封堵、进样器针头磨损或进样器流速不稳定所致。
解决方案包括清洗进样器、更换进样器针头或调整进样器流速稳定性。
8.柱温度不稳定-柱温度不稳定可能是由于温控系统故障或环境温度变化所致。
解决方案包括检查温控系统是否工作正常或采取措施保持恒定环境温度。
这些是HPLC常见故障及其解决方案的例子。
在实际操作中，操作人员应该根据具体情况诊断和解决故障，并遵循相关的操作规程和安全操作指南。
高效液相常见故障及解决方法
3、高效液相色谱仪常见故障处理LC-10AT高效液相色谱仪是日本岛津公司1996年的产品，检测器为可变波长紫外检测器，色谱柱为岛津公司的ODS-C18，大连依利特的ODS-C18。
八年的日常工作中遇到了几种故障，如故障1经咨询岛津公司的工程师后，得以解决；故障2、故障5是频繁碰到的问题等，特作总结如下：故障1 流动相内有气泡，关闭泵，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入流动相，无论打开purge键几次，都无法清除不断产生的气泡。
原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开泄压阀，打开purge 键，清洗脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏，流动相可以流畅地通过过滤器。
打开泄压阀，打开泵，流速调至1.0～3.0ml/min ，纯水冲洗过滤器1小时左右。
即可将过滤器清洗干净。
关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。
故障2柱压高原因（1）缓冲液盐分如（乙酸铵等）沉积于柱内；（2）样品污染沉积。
处理对于第一种情况先用40～50 ℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30 分钟；对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲洗柱子（冲洗时间的长短由样品污染的情况而定），再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
故障3既无压力指示，又无液体流过。
原因（1）泵密封垫圈磨损；（2）大量气泡进入泵体。
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法1 色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。
待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。
2.基线不稳，有静电，处理方法：检查接地是否良好。
3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。
4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。
5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。
高低流速交替冲洗。
6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。
7塔板数低：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响8色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理（PH<3或PH>7）10保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性选择波长要从以下几个方面考虑：1. 检测波长要大于溶剂截止波长。
如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。
溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。
2. 对各组分都要有适当的吸收。
一般是不可能做到的。
所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。
3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。
254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。
对饱和基团也有弱的吸收。
而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。
是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。
（一）涡流扩散（Eddy diffusion）流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。
如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。
因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
高效液相色谱常见故障及解决方案
清洗柱或更换柱 清洗六通阀 清晰检测器
管路污染
冲洗
流动相中含有稳定剂 或稳定剂变化
使用无防腐溶剂
8.保留时间变 化
现象
保留时 间不重 复
判断
系统不问或未达 到平衡
室温波动大
柱被污染 溶剂配比不合适 进样体积太大或 样品浓度太高
故障排除
分析之前应有足够的时间 使系统平衡 使用柱温箱、将系统置于 恒温、空气对流小的环境 冲洗柱或更换柱 调节溶剂配比
检测器内有气泡
用甲醇或其他强极性的溶剂 冲洗流通池
用强极性的溶剂清洗系统
清洗检测器，在检测器后面 安装背景压力调节器
检测器灯能量不足
更换灯
12.规则基线 噪音
现象
规则基 线噪音
判断
故障排除
流动相、检测 器或泵内有气 泡
流动相脱气，冲洗系统除去检 测器或泵内的空气
室温不稳
稳定环境温度。使用柱温箱、 将系统置于恒温、空气对流小 的环境
鬼
洗脱物
峰
注射器脏
故障排除
用标准品对照、检查样品处理过程， 换新样品
增加分析时间或梯度洗脱、提高流 速、如问题仍存在，两次进样间用 强溶剂冲洗色谱柱
清洗注射器、冲洗进样口
现象
判断
故障排除
流动相被污染
清洗溶剂贮液瓶、清洗溶剂入 口过滤器、使用HPLC级试剂
色谱图 出现鬼 峰
柱被污染 六通阀污染 检测器污染
峰变 宽
环境温度变化 漏夜
使用柱温箱 检查漏夜的位置并维修
出现两个或多个未被完 全分离的物质的峰
选择其它色谱条件以改善分 离效果
检测器时间常数太大
使用较小的时间常数
4.峰分叉
高效液相色谱使用过程中的常见问题及解决方法
高效液相色谱使用过程中的常见问题及解决方法2014-07-02高效液相色谱技术,HPLC 是近期发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离、分析技术.它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，灵活多样，应用范围已超过其它各种分离方法。
如果HPLC使用人员能在分析样品之时就熟悉常见的问题并加以解决，就能避免许多麻烦，让您在HPLC使用过程中轻松应对。
1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(见图1)。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是易出问题的主要部位。
2 高效液相色谱仪常见问题及解决方法高效液相色谱仪作为一种高精密仪器，如果在使用过程中操作不当的话,就容易导致一些问题，其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰形异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内(在使用梯度洗脱时，柱压平稳、缓慢的变化是允许的)。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相色谱仪在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的情况。
此时，我们应该分段进行检查。
①首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡0.5h，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，再检查。
②打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤头堵塞。
处理方法：将过滤头取出，用10%的异丙醇超声30min。
如果压力降至690kPa以下，过滤头正常，再检查。
③把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
高效液相色谱操作常见问题
⾼效液相⾊谱操作常见问题⾼效液相⾊谱的常见问题分析⼀、⾼效液相⾊谱仪操作步骤1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)．对抽滤后的流动相进⾏超声脱⽓10-20分钟。
3)．打开HPLC⼯作站（包括计算机软件和⾊谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)．进⼊HPLC控制界⾯主菜单，点击manual，进⼊⼿动菜单。
5)．有⼀段时间没⽤，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出⽔⼝，⽤针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6)．调节流量，初次使⽤新的流动相，可以先试⼀下压⼒，流速越⼤，压⼒越⼤，⼀般不要超过2000。
点击injure，选⽤合适的流速，点击on，⾛基线，观察基线的情况。
7)．设计⾛样⽅法。
点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种⾛样⽅法。
若需建⽴⼀个新的⽅法，点击new method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要⽽不同。
选完后，点击protocol。
⼀个完整的⾛样⽅法需要包括：a.进样前的稳流，⼀般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.⾛样时间，随不同的样品⽽不同。
8)．进样和进样后操作。
选定⾛样⽅法，点击start。
进样，所有的样品均需过滤。
⽅法⾛完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品⾛完后，再⽤上⾯的⽅法⾛⼀段基线，洗掉剩余物。
9)．关机时，先关计算机，再关液相⾊谱。
10)．填写登记本，由负责⼈签字。
⼆、注意事项：1)．流动相均需⾊谱纯度，⽔⽤20M的去离⼦⽔。
脱⽓后的流动相要⼩⼼振动尽量不引起⽓泡。
2)．柱⼦是⾮常脆弱的，第⼀次做的⽅法，先不要让液体过柱⼦。
3)．所有过柱⼦的液体均需严格的过滤。
4)．压⼒不能太⼤，最好不要超过2000 psi三、提⾼HPLC检测限、溶剂脱⽓等的⼏点经验1、仅针对⽤反相碳⼗⼋烷基硅烷化填料的柱⼦和紫外检测器的HPLC通常在理论教学时，HPLC分析总要求实⽤HPLC纯的试剂、⽤孔径⽐填料粒度⼩的微孔滤膜过滤流动相、最好⽤真空或氦⽓脱⽓。
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高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法●高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
●常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI（针对Waters高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
问题无法解决可考虑更换色谱柱。
2、流速设定不正确：可重新设定正确流量。
3、流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。
4、系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。
5、阻尼器堵塞：拆下后进行超声波清洗或更换新的阻尼器。
6、进样器堵塞：参见说明书清洗。
7、管路或连接口堵塞：更换被堵塞管路或按说明书进行清洗。
8、柱端过滤器堵塞：拆下过滤器用硝酸超生清洗9、长期使用柱端固定相板结：挖掉板结部分修补柱端10、分析生化、染料等易污染固定相的样品：方法同上, 采用保护柱1.2 压力过低1、一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。
拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜。
2、泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。
处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
3、无流动相流出：检查储液瓶中有无流动相，沉子是否浸在流动相中，泵是否运行。
4、参比阀未关闭：将流速降低后关闭参比阀。
一般降至0.1～0.2mL/min后关闭参比阀。
1.3其它压力问题1、压力传感器故障，柱压升高或降低或无柱压:与供应商联系进行维修。
2、系统管路中存在气泡，柱压不稳：重新进行排气操作。
( 可重复多次，直至气泡排出)3、沉子表面的小孔被堵塞，柱压在较大范围内波动：将沉子取下后进行超声波清洗。
2 基线问题2.1基线漂移基线漂移是色谱工作者普遍遇到的问题,在实际工作中,我们经常能遇到基线漂移的情况,特别是在梯度洗脱的时候,基线漂移是常有的事。
一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要30min 的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：1、柱温波动控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
)控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。
2、流通池被污染或有气体用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。
如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。
3、紫外灯能量不足更换新的紫外灯4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。
检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂。
5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
使用保护柱，如有必要，在进样之间。
在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
6、检测器没有设定在最大吸收波长处将波长调整至最大吸收波长处7、流动相的PH值没有调节好加适量的酸或碱调至最佳PH值8、流动相不均匀: (流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
)使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂,流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
9、检测器出口阻塞: (高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)取出阻塞物或更换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
10、流动相配比不当或流速变化:更改配比或流速。
为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
11、柱平衡慢特别是流动相发生变化:用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10～20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
12、使用循环溶剂,但检测器未调整:重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
2.2基线噪音对于紫外检测器, 氘灯光源打开后要预热30 min以上, 基线才能稳定。
噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化, 分短期噪声和长期噪声两种。
氘灯用的过久, 接近寿命期时( 氘灯的寿命约1 000 h) , 会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。
除光源外, 流路中的气泡也会产生噪音。
对于判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡的问题, 可将泵关上, 继续走基线, 如果噪声立即停止, 基线呈一条直线, 说明基线噪声来自流动相中的气泡, 应设法排气; 若停泵后仍有噪音出现, 应考虑是灯的问题。
电化学检测器中的工作电极( 安培型) 对气泡十分敏感, 仪器的平衡时间较长。
流路中如果有气泡存在, 不仅基线会出现尖峰, 还会影响检测。
因此,做电化学检测时, 流动相的配制要很严格, 水要超纯、除还原物, 配好后一定要过滤脱气, 还应现用现配。
如果泵系统不是PK 材料, 即电化学分析专用仪器, 而是普通的高效液相色谱不锈钢泵, 应对系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道, 在分析前用6 mol·L-1 硝酸溶液钝化( 注意断开分离柱) , 可缩短基线平衡时间。
还可在流动相中加入EDTA 离子隐蔽剂, 也是可以的。
如果有较大的气泡进到检测器中, 光靠泵冲可能太慢, 可暂时将泵停止, 关上电化学检测器, 拆下工作电极, 用超纯水冲洗电极表面, 也很奏效的, 但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作, 不宜反复这样拆卸。
2.2.1 基线噪音(规则的)产生基线噪音的原因有：在流动相、检测器或泵中有空气；漏液；流动相混合不完全；温度影响(柱温过高,检测器未加热)；在同一条线上有其他电子设备；泵振动。
了避免基线噪音,在正式进样之前,需要对流动相脱气；冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；检查管路接头是否松动；泵是否漏液；是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封；用手摇动使溶剂混合均匀或使用低粘度的溶剂减少差异或加上热交换器；有其他电子设备时断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正；泵振动时在系统中加入脉冲阻尼器。
2.2.2 基线噪音(不规则的)(1) 漏液：检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要,更换密封,检查流通池是否漏液。
(2) 流动相污染、变质或由低质溶剂配成：检查流动相的组成。
(3) 流动相各溶剂不相溶：选择互溶的流动相。
(4) 检测器/记录仪电子元件的问题：断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
(5) 系统内有气泡：用强极性溶液清洗系统；检测器内有气泡,清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器。
(6) 流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音) :用硝酸清洗流通池;(7) 检测器灯能量时不足更换灯;(8) 色谱柱填料流失或阻塞:更换色谱柱。
(9) 流动相混合不均匀或混合器工作不正常:维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,不建议使用泵的混合装置。
3 保留时间3.1保留时间漂移保留时间的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。
事实上,保留时间漂移的多半原因是由于不同机理的色谱柱老化,如固定相流失(例如通过水解) ,色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。
保留时间漂移的几种最常见的原因和解决方法如下：(1) 色谱柱平衡如果观察到保留时间漂移,首先应考虑色谱柱是否已经平衡。
在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
通常平衡需要10～20个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。
流动相污染也可能是原因之一。
溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上,从而造成保留时间的漂移。
应注意:水是很容易污染的流动相成分。
(2) 固定相稳定性固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的pH范围内使用,固定相也会慢慢水解。
例如,硅胶基质在pH4时水解稳定性最好,水解速度与流动相类型和配体有关。
双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定;长链键合相比短链键合相稳定;烷基键合相比氰基键合相稳定的多。
经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。
其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解,如氨基键合相等。
(3) 色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。
HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器,它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。
污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。
通常通过实验可判断污染的来源。
样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分,就可能是使保留时间漂移的潜在根源。
这些根源通常是样品基质,如:配药中的赋形剂,生化样品(如血清)中的蛋白及类脂类化合物,食品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。
通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加,可以通过使用固相提取( SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响,避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。