色谱分离
色谱法分离
色谱法分离
色谱法分离（Chromatography）是一种技术，它可以分离和分析各种化学物质，如溶剂、溶剂混合物和混合液体。
色谱法分离技术广泛应用于各种科学领域，包括分子生物学、化学、植物学和生物医学。
色谱法分离技术主要依靠分子间的相互作用来分离和分析各种
化学物质和混合液体。
为了将混合液体中的化学物质分离开来，需要将混合液体放置在一种特定的基础上，如纸张或液体相平面上。
然后，该基础物质被加入溶剂，并以某种速度移动，这些速度的不同可以使不同的化学物质分离出来，这样就可以对这些化学物质进行分析和研究。
色谱法分离技术可以被用来分析化学物质的组成，以及它们之间的相互作用。
它还可以帮助我们了解分子的性质，比如它们的分子量、表面张力和电荷数。
由于色谱法分离技术可以提供关于分子的精确的信息，所以它被广泛用于分离和分析各种混合物。
此外，色谱法分离技术还可以用来研究生物样本中的有机物，这些有机物包括蛋白质、酶、抗体、激素和基因等。
这些有机物因其在环境中的可溶性而极为重要，因此研究它们可以帮助我们更好地了解关于它们的结构和功能。
色谱法分离技术可以将这些有机物从环境中分离出来，从而可以更好地研究其组成和功能。
色谱法分离技术是一种强大的分离分析技术，可以用来研究化学物质、混合液体，以及生物样本中的有机物。
它的应用可以深入探索各种科学问题，为解决社会问题提供有效的方法。
色谱法分离技术的
发展对人类文明的发展起着至关重要的作用，它为我们提供了一种全新的手段来探索宇宙中最奥秘而又最有价值的物质。
色谱分离方法分类
色谱法是目前分离三萜类化合物最常用的方法，通常采用多种色谱法相组合的方法：
①吸附柱色谱法；②分配柱色谱法；③高效液相色谱法；④大孔树脂柱色谱；
⑤凝胶色谱法。
（1）吸附柱色谱法：
①常用方法，可用于分离各类三萜化合物。
②依据所用的吸附剂性质的不同，分为正相吸附柱色谱和反相吸附柱色谱。
③正相吸附柱色谱的吸附剂常用硅胶。
④反相柱色谱通常以键合相硅胶Rp-18、Rp-8或Rp-2等为填充剂。
（2）分配柱色谱法：多用于分离皂苷，常用硅胶等作为支持剂，固定相为3%草酸水溶液等，流动相为含水的混合有机溶剂：如氯仿-甲醇-水，正丁醇-水等。
（3）高效液相色谱法：是目前分离皂苷类化合物最常用的方法，分离效能较高。
用于皂苷的分离制备一般采用反相色谱柱，以甲醇-水、乙腈-水等系统为洗脱剂。
（4）大孔树脂柱色谱：适用于皂苷的精制和初步分离。
操作：将含有皂苷的水溶液通过大孔树脂柱后，先用水洗涤除去糖和其他水溶性杂质，医|学教育网搜集整理然后再用浓度由低到高的甲醇或乙醇依次进行
梯度洗脱，极性大的皂苷可被l0%～30%的醇洗脱下来，极性小的皂苷则被50%以上的醇洗脱下来。
（5）凝胶色谱法：分子筛的原理来分离分子量不同的化合物，在用不同浓度的甲醇、乙醇或水等溶剂洗脱时，各成分按分子量递减顺序依次被洗脱下来。
即分子量大的皂苷先被洗脱下来，分子量小的皂苷后被洗脱下来。
应用较多的是在有机相中使用的SephadexLH-20.。
色谱分离技术
二、离子交换树脂的性能 1. 交联度（degree of cross linking）： 离子交换 交联度（ ）： 树脂上胶联剂的含量称为交联度。 树脂上胶联剂的含量称为交联度。交联度用重量百分 比表示， 标号树脂， 比表示，如“×4”标号树脂，其交联度为 标号树脂 其交联度为4%。应根据 。 试样性质进行选择。 试样性质进行选择。 2.交换容量：每千克干树脂能参加交换反应的活 交换容量： 交换容量 性基团数， 表示。 性基团数，用mmol/g or mmol/ml表示。 表示 粒度：离子交换树脂颗粒的大小， 粒度：离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态 所能通过的筛孔数表示。 所能通过的筛孔数表示。 三、流动相 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。有酸 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的pH， 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的 ，缓冲液的 类型，离子强度， 类型，离子强度，以及加入的有机溶剂都会影响组分 的分离。 的分离。
二、纸色谱法 （一）基本原理 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法。 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法 。 固定相 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺、缓冲液等。 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺 、 缓冲液等 。 流动 相为与水不相混溶的有机溶剂。 相为与水不相混溶的有机溶剂 。 因为吸附在纤维上 20%的水分中，有约 的水分中， 的水分中 有约6%可通过氢键与纸纤维素上的羟 可通过氢键与纸纤维素上的羟 基结合生成复合物，与亲水性溶剂可形成两相。 基结合生成复合物 ， 与亲水性溶剂可形成两相 。 纸色 谱法属分配色谱， 谱法属分配色谱 ， 是利用样品组分在两相间分配系数 的不同达到分离的目的。实际上，纸色谱的分离机制 的不同达到分离的目的。 实际上， 较复杂，除分配外， 较复杂 ， 除分配外 ， 可能还有溶质与纸纤维素间的吸 附作用，与纸纤维素上某些基团（ 附作用 ， 与纸纤维素上某些基团 （ 造纸时引入到纤维 素上的）之间的离子交换作用。 素上的）之间的离子交换作用。
色谱法分离纯化流程及注意事项
色谱法分离纯化流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 样品制备。
将待分离的样品溶解或悬浮在合适的溶剂中。
色谱分离
第一章色谱分离1.1基本概念1906年，俄国植物学家Tsweet提出色谱，他用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。
色谱现象：1)一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来2)一种是被石油醚溶解，使色素向下移动3)各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。
定义：色谱法是利用不同物质在互不相溶的两相中具有不同的分配系数，并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法。
原理：利用混合物中各组分的物理、化学性质（溶解度、分子极性、分子大小和形状、吸附能力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相、流动相)中达到分离固定相(Stationaryphase)：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。
流动相(Mobilephase)：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。
1.2色谱法的特点优点：高选择性：可将性质相似的组分分开高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好的分离效果高灵敏性：适于痕量分析分析速度快：十几分钟完成一次；可以测多种样品应用范围广：气液固物质，化学衍生缺点：对未知物分析的定性专属性查需要与其他分析方法连用1.3分类1.3.1按照固定相1)柱色谱法2)纸色谱法3)薄层色谱法1.3.2按照流动相1)气相色谱法2)液相色谱法1.3.3按照分离机理分类1)凝胶色谱法2)离子交换色谱法3)吸附色谱法4)亲和色谱法1.3.4按照分离的对象1)凝胶过滤色谱（GFC）2)凝胶渗透色谱（GPC）1.4固定相1)一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质2)凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。
色谱分离过程具备的条件
色谱分离过程具备的条件
色谱分离过程具备的条件包括：
1. 有效的分离介质：色谱分离过程中需要使用一种适当的分离介质，如固定相或移动相。
固定相通常是固体或涂在固体上的液体，而移动相通常是液体或气体。
2. 合适的样品处理方法：样品在进入色谱仪之前，通常需要经过一些前处理步骤，如稀释、过滤、萃取等，以提高分离效果或减少可能的干扰。
3. 适当的分离机制：色谱分离基于不同物质在分离介质中的亲和性差异。
不同物质的分离机制可以有吸附、分配、离子交换、排阻等方式。
4. 适当的温度和压力控制：温度和压力的控制可以影响色谱分离的效果和速度。
不同物质具有不同的热力学性质和溶解度，因此适当的温度和压力条件对于实现高效的分离是必要的。
5. 良好的仪器设备：色谱分离通常需要使用高质量的色谱柱、色谱仪及其配套的进样器、检测器等设备，以保证准确和精确的分离过程。
6. 专业的操作技术：色谱分离过程需要操作人员具备一定的专业知识和实践经验，以正确操作仪器设备、准确调节分离条件，并正确解读和分析分离结果。
色谱分离的技术
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离
高效液相色谱仪
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
离子交换色谱
• 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带 电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律， 这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相 基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子 交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可 用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫 做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2， 及－MH3+ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－ COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于 强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换 能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只 有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交 换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动 分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、 核苷和各种碱基的分离等。
色谱法的发展历程
◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同， 一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不 易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。
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流动相有气体和液体两种。在经典柱色谱中流动相也称为洗脱剂， 液相色谱的流动相通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸 等）组成。流动相对样品组分要有一定的溶解度；粘度小，易流动； 纯度要高。
• 色谱分离原理小结
● 不同组分性质上的微小差别是色谱分离的必要条件 ● 不同组分在两相中进行成千上万次的质量交换（分配） 是色谱分离的充分条件
3、固定相和流动相
色谱分离体系有两个相构成，固定的一相称为固定相（stationary phase），移动的一相称为流动相（mobile phase）。
色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流 动相，使分配系数K值适当，以实现定量分离的目的。因此，固定相 和流动相的选择是色谱分离的关键。
4、分配系数
• 在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这 个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相， 即在两相之间进行分配。分配系数定义为 ：
• 茨维特的色谱实验 将一植物色素的石油醚溶液从一根主要填有碳酸钙吸附剂的直立
玻璃管上端倒入，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分 互相分离形成各种不同颜色的谱带。当时Tswett把这种色带叫做“色谱” （Chromatography），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫 作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。
主要内容
色谱法概述 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 现代色谱分离技术
（气相色谱，HPLC，超临界流体色谱）
6.1 色谱法概述
1、基本概念 色谱法（Chromatography）又称层析法、色层法，是一种高 效分离方法，能把各种性质相似的物质彼此分离。 色谱法是一种多级分离技术，基于被分离物质分子在两相 （固定相，流动相）中分配系数的微小差别进行分离。当两相 作相对移动时，被测物质在两相间进行反复多次分配，微小差 别放大，使各组分分离。
对于确定的色谱体系，K值在低浓度和一定温 度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、 吸附、离子交换等速度慢。两个化合物之间的K 值相差越大，越容易分离。
5、分类
按流动相种类分类
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
按固定相所处的状态分类
柱色谱主要有吸附色谱和分配 色谱两类。前者常用氧化铝或 硅胶为柱填料。后者以硅胶、 硅藻土和纤维素为支持剂，以 吸收一定量的特殊液体作为固 定相。
1 、吸附柱色谱法分离原理
吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间 的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。当组 分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子 的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。当洗脱剂 连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用 力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下， 吸附和溶解达到平衡。但由于洗脱剂不断地移动，这种 吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子 就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗 脱剂的流速有关。当流速一定时，各组分就依据吸附平 衡常数的不同而得到分离。
柱色谱：将固定相颗粒装填在金属或玻璃柱内 进行色谱分离。
纸色谱：利用滤纸作为固定相进行色谱分离。 薄层色谱：把吸附剂粉末做成薄层作为固定相 进行色谱分离。
按色谱过程的机理分类
吸附色谱：利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸 附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。 分配色谱：利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶 解度差异来达到分离的。 离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力 的不同而达到分离的一种色谱方法。 凝胶色谱（排阻色谱）：利用惰性多孔物，如凝胶， 对不同组分分子的大小而产生不同的滞留作用，以 达到分离的色谱方法。 亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在某种 特异亲和力，进行选择性分离的一种方法。
2 、吸附色谱柱填料
在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍 有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂） 和流动相（洗脱剂）。吸附剂的选择主要根据吸附剂性质 和分析要求通过实验来现在。
对吸附剂的一般要求：
2、方法原理
• 色谱分离过程：当含有不同化合物的试液加样后，它们在同 一时刻进入色谱柱上端，同时在固定相和流动相之间分配。 分配在流动相的样品组分随流动相流动，而分配在固定相的 样品组分则滞留不动。当混合物样品被流动相携带通过色谱 柱时，它们在两相之间进行反复多次（通常在100次以上）分 配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了 保留能力明显差异的分离效果，造成不同组分在色谱柱的移 动速度不同。经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最 后按一定顺序流出色谱柱。
色谱法
气相色谱法
液相色谱法
超临界流体色谱法
气
气
液
固
色
色
谱
谱
法
法
平板色谱法
柱色谱法
离
薄 层 色 谱 法
分吸子 排 亲
纸
配附交 阻 和
色
色色换 色 色
谱
谱谱色 谱 谱
法
法法谱 法 法
法
6.2 柱色谱法
柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形 式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、简便 和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物 的纯化。
色谱法已发展为专门学科，经典的液相色谱法，包括柱色谱、 纸色谱和薄层色谱。
气相色谱和高效液相色谱已成为仪器分析的重要分支。
• 色谱法创立者的是俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）。 1903年3月21日，他在华沙自然科学学会生物学会议上发表了"一种新 型吸附现象及其在生化分析上的应用"研究论文，介绍了一种应用吸附 原理分离植物色素的新方法，即著名的茨维特的色谱实验。1906年他 又在德国植物学杂志发表文章，首次将分离后色带命名为色谱图，称 此方法为色谱法（Chromatography）。