金葡菌表型实验
金黄色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂 肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然 的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生 磷脂环。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
生物学特性 ——致 病 性
•金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取 决于其产生的毒素和侵袭性酶： •a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌 体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 •b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； •c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 •d.耐热核酸酶 •e.肠毒素：引起急性胃肠炎。
有毒性，并使菌落产生黑色
✓ 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环
✓ 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制 作用。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
在BP平板上典型菌落为：圆形,表面光滑、凸起、湿 润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽, 常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常 有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
•葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病， 可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突 出而且普遍，腹痛、腹泻次之。 •当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如 牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10 小时即可相当数量的肠毒素。
利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（最高可耐受 15%的氯化钠），用7.5%氯化钠肉汤增菌。
金葡球菌实验报告
一、实验目的通过本次实验，掌握金黄色葡萄球菌的分离、培养和鉴定方法，了解其生物学特性，为临床诊断和治疗提供依据。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株2. 培养基：普通琼脂、血琼脂、Baird-Parker培养基、营养肉汤3. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、移液器、试管、培养皿等4. 实验试剂：革兰氏染色液、碱性复红液、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甲基红等三、实验方法1. 菌株分离与纯化（1）将金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。
（2）取培养好的肉汤，用无菌移液器吸取适量接种于普通琼脂平板，37℃培养24小时。
（3）挑取单菌落，接种于血琼脂平板，37℃培养24小时。
（4）挑取单菌落，接种于Baird-Parker培养基平板，37℃培养24小时。
2. 鉴定试验（1）革兰氏染色：取纯化后的金黄色葡萄球菌，进行革兰氏染色，观察菌体形态。
（2）生化试验：进行触酶实验、葡萄糖发酵实验、麦芽糖发酵实验、乳糖发酵实验、蔗糖发酵实验、甲基红反应、VP反应等，以确定金黄色葡萄球菌的生化特性。
（3）溶血试验：观察金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的溶血情况。
（4）过氧化氢酶试验：观察金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上的过氧化氢酶反应。
四、实验结果1. 菌株分离与纯化在普通琼脂平板、血琼脂平板和Baird-Parker培养基平板上均分离出金黄色葡萄球菌，菌落呈圆形、凸起、表面光滑、湿润、不透明，产生黄色脂溶性色素。
2. 革兰氏染色金黄色葡萄球菌革兰氏染色阳性，呈球形，排列成葡萄串状。
3. 生化试验金黄色葡萄球菌触酶实验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、产酸不产气，甲基红反应阳性，VP反应阴性。
4. 溶血试验金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生溶血环。
5. 过氧化氢酶试验金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上产生黑色沉淀。
五、实验结论根据实验结果，分离出的金黄色葡萄球菌符合金黄色葡萄球菌的生物学特性，可以确认为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检测方法ppt课件
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1
葡萄球菌属（Staphylococcus）
引起毒素型食物中毒 分为：金黄色葡萄球菌
表皮葡萄球菌 腐生性葡萄球菌
对于加工过的食品或食品加工 设备而言，此菌或其肠毒素的 存在通常作为卫生条件差的一 种指标。
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金黄色葡萄球菌的扫描 电镜照片
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2.2 葡萄球菌属（Staphylococcus）
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3 培养 在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易 吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱， 36 ℃±1 ℃培养，45 h～48 h。
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4 典型菌落计数和确认 1）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混 浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油 至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但 无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离 的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并 干燥。
生物学特性 1、形态与染色特性
G+，无芽孢、无鞭毛、无荚膜、不运动 2、培养特性： ① ② ③ ④ ⑤ 3、生化特性：MR阳性，V－P弱阳性，靛基质阴性…… 4、抵抗力
具有较强的抵抗力，80 ℃ 30min 5、抗原结构
蛋白抗原——表面抗原，无特异性。 多糖抗原——半抗原，有型特异性
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食品中金黄色葡萄球菌的检验
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4 典型菌落计数和确认 2）如果： d） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落， 且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不 在20 CFU～200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型 菌落；以上按公式（1）计算。 e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算。 3 ) 从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），分别 做血浆凝固酶试验。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌五种表型检测法的评价
１１ 主要 仪器 与试剂 Ｖ Ｔ Ｋ ３ 全 自动细菌 鉴 ．２ ． Ｅ Ｉ－２
便、 快速 的优势 ， 因此 在临床 上得 到广泛应 用 。为 比
较 和评 价各 种 ＭＲ Ａ 的表 型检测 方法 ， Ｓ 以利 于 临床
定 仪 系 生 物 梅里 埃 公 司 产 品 ：ｉ ｔ ｃ ｒ 光 Ｐ Ｒ Ｌｇ ｃ ｌ 荧 ｈ ｙｅ Ｃ
球 菌 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 质 控 菌 株 Ａ Ｃ ４ ３０ Ｔ Ｃ ３０ 、
Ａ Ｃ ２ ９ ３ Ａ Ｃ ２ ２ ３购 自于 国家 药 品生 物 制 品 Ｔ Ｃ５２、Ｔ Ｃ ９１
检定 所 。 ．
其感染的关键［ 目前 ， Ｒ Ａ的主要检澳方法有表 ２ １ 。 Ｍ Ｓ
型 检 测法 和基 因检 测 法 表 型检 测 法 由 于具 有 简
扩 散 法 （ １ ％ ）Ｖ Ｔ Ｋ仪 器法 （ １ ％）苯 唑 西林 琼 脂 筛 选法 （３ ％ ）苯 唑西 林 纸 片 扩 散 法 （３Ｏ ）特 ９ ． 、 ＩＥ ９ ９． 、 ９ ７． 、 Ｏ ７． ； ％
异 性 以 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 、 唑 两林 纸 片扩 散 法 、 苯 苯唑 西 林 琼 脂 筛 选 法 为 最 高 （ 为 １０ ， 均 ０ ￣） 随后 依 次
为 ＶＴ Ｋ仪 器 法 （３ ％ ）头 孢 西 ｒ 脂 筛 选 法ｆ３１ ； ＩＥ ９． 、 ４ 琼 ９ ％）五种 表 型 法 Ｒ Ｃ 曲线 下 面积 按 大 小 依 移 为 ： Ｏ （ 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 ０ ５ 、 孢 西 丁 琼 脂 筛 选法 ０ ５ 、 Ｉ ． ９头 ９ ． ２Ｖ ｑ 仪 器 法 ０ ２ 、 唑 西 林 琼 脂 筛 选 法 Ｏ８ ５ ９ ￣Ｋ ， ５苯 ９ ． 、 ６
金黄色葡萄球菌抗生素耐药表型和基因型研究
金黄色葡萄球菌抗生素耐药表型及基因型研究
摘 要
目的：随着抗生素的大量使用，耐受多种抗生素的金黄 色葡萄球菌相继出现，并且呈快速增多趋势，按照耐受抗生 素的类型，主要包含Ｂ内酰胺类耐药、氨基糖苷类耐药、四 环素类耐药。本文主要探讨了２００５年１月～２００６年１０月分 离自河北省第四医院住院患者的金黄色葡萄球菌对抗生素 表型耐药状况，并用聚合酶链式反应对相关耐药基因进行检 测，通过耐药表型和耐药基因型结果的对比分析，了解河北 省第四医院近两年来患者感染的金黄色葡萄球菌耐药情况。 方法：收集２００５年１月～２００６年ｌＯ月分离自河北省肿 瘤医院患者的金黄色葡萄球菌７４株，采用抗生素纸片扩散 法（Ｋ－Ｂ）测定抑菌环直径，用抗生素微量肉汤稀释法测定 最低抑菌浓度（ＭＩＣ），检测上述７４株细菌对阿莫西林／棒酸、 头孢唑啉、头孢噻肟、头孢噻吩、庆大霉素、苯唑青霉素、 青霉素、四环素、万古霉素等１０种抗生素的敏感性；同时， 根据从ｇｅｎｅｂａｎｋ检索到的耐药基因序列，设计了特异性引 物，采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测该金黄色葡萄球菌抗 生素的耐药基因，对上述部分基因进行序列分析。 结果：１．对抗生素的敏感性：呈多重耐药。对所有上述 抗生素的耐药率均在６０．０％以上。ＭＲＳＡ多重耐药菌株占６４％ 以上。ＭＳＳＡ的表型耐药性和耐药基因的检出结果基本一致。
关键词：金黄色葡萄球菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （ＩｑｌＲＳＡ）；聚合酶链式反应
英文摘要 Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ
ａｕｒｅｕｓ
ＡＢＳ’Ｉ‘ＲＡＣ’ｒ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ
４．四环素类耐药，四环素表型耐药率为７４．３２％，ＴＥＴＭ
金黄色葡萄球菌检验方法
3、涂片、染色与镜检
将纯培养的未知菌涂片，革兰氏染色，显微镜观察。
4、生化实验
①触酶试验
在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧 化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气 泡者为阴性。
②血浆凝固酶试验
吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h 的2①中的肉汤培养液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1℃） 恒温箱中培养，每0.5h观察一次，观察6h，检查是否出现凝 固。将试管倾斜或倒置时，呈现凝块状，可判定为阳性，同 时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。
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5、动物感染实验
用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后，以 0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内，同时用灭菌生理盐水注射 入另外的小白鼠体内，以做对照，分别在相同条件饲养，观 察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检， 并采集病料，进行分离。
二．结果与分析
1、培养特性及形态特征
2、方法
待检样品25g+225ml灭菌生理盐水
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直接计数法
金黄色葡萄球菌检验实验原理
金黄色葡萄球菌检验实验原理
金黄色葡萄球菌检验是一种常见的微生物检验方法，用于检测环境中是否存在金黄色葡萄球菌。
实验原理：
1.准备好检测环境样品。
2.将样品加入培养基中，培养基中含有可抑制其他细菌生长的
物质。
3.将培养基移植到培养皿中，利用平板法悬浮液平铺在培养皿
表面。
4.将培养皿置于孵箱中，设定适当的温度和时间，有利于金黄
色葡萄球菌的生长。
5.观察培养皿上是否有金黄色菌落的出现。
6.对金黄色菌落的特征进行仔细观察，如菌落的形状、颜色等。
7.进行进一步的鉴定确认，通过其他实验方法验证金黄色菌落
是否为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检验实验原理简单易懂，能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的存在与否。
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的革兰氏阳性球菌，广泛存在于自然界中，同时也是人体皮肤和黏膜的正常微生物。
金黄色葡萄球菌也是人体病原微生物中的一种，并且可以引起一系列的感染疾病，包括皮肤感染、肺炎、败血症等严重疾病。
及时、准确地检测金黄色葡萄球菌对于预防和控制与该菌相关的疾病具有重要意义。
金黄色葡萄球菌的检验技术主要包括细菌培养、生化鉴定、药敏试验等，下面将对这些技术进行介绍。
一、细菌培养1. 培养基金黄色葡萄球菌主要可在营养琼脂、大豆肉汤琼脂、牛肉心脏培养基等细菌培养基上生长。
营养琼脂是最常用的培养基，可用于对金黄色葡萄球菌的初步筛查。
2. 培养条件金黄色葡萄球菌在37°C下培养24-48小时，产生充分的菌落。
3. 形态特征金黄色葡萄球菌在琼脂培养基上可形成金黄色的圆形菌落，直径一般在1-2mm左右。
二、生化鉴定1. 皮肤试验皮肤试验是金黄色葡萄球菌的特异性鉴定方法之一，又称为凝集素试验。
通过皮肤试验，可以判断金黄色葡萄球菌是否具有产生凝集素的能力。
2. 协和试验协和试验又称凝集酶试验，是用于检测金黄色葡萄球菌产生凝集酶的一种生化试验。
该试验通过将金黄色葡萄球菌的培养液加入到含有凝集酶专一底物的试管中，观察底物被溶解的情况，用于判断金黄色葡萄球菌是否产生凝集酶。
3. 床旋试验床旋试验又称为巯基甲酸盐试验，是一种利用巯基甲酸盐来检测金黄色葡萄球菌的特异性试验。
通过观察琼脂培养基上金黄色葡萄球菌菌落周围出现的红色环的形成情况，判断金黄色葡萄球菌是否产生巯基甲酸盐酶。
4. 溶血酶试验溶血酶试验是一种通过检测金黄色葡萄球菌产生的溶血酶来鉴定其特性的生化试验。
溶血酶试验主要有两种方法：血凝素试验和牛血红蛋白试验。
这两种方法都是通过观察金黄色葡萄球菌对红细胞造成的溶血现象来判断其产生的溶血酶。
三、药敏试验药敏试验是检测金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的一种方法。
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2.2.5金黄色葡萄球菌的相关表型实验方法
2.2.5.1生长曲线的测定
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，接种至含有1
ml TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）1:100 将菌转接入含有50 ml TSB，MH 或PN 培养基的250 ml 烧瓶中，37 ℃震荡培养（转速220 RPM）。
（3）每小时测量各瓶OD600 数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约
12 小时）。
2.2.5.2 自溶实验
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至TSB 培养
基中，于37 ℃振荡培养至指数中期。
（2）离心10 min，回收细胞。
（3）用PBS 洗细胞，重复三次。
（4）将细胞重悬于等量含有0.05% （W/V）Triton X-100 的Tris-HCl （pH 7.5）
缓冲液中。
（5）将细胞重悬液于30 ℃振荡培养（转速220 RPM）。
（6）从测量零时开始，每隔30 min 测量OD600 的值，直到OD 值降到初始
值的一半以下。
2.2.5.3 生物膜实验
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）将过夜培养的金葡菌按照1:100 的接种量接种至新鲜TSB 培养基，混
匀。
（3）将混合接种物分装至96 孔板（Costar 3599），每孔或者24 孔板（Costar 3524），每孔。
在37 ℃恒温箱静置培养。
（4）培养一定时间后，取出孔板，弃掉上清，并用水轻柔地洗孔板三次。
（5）每孔加入（96 孔板）或（24 孔板）结晶紫染色液，常温
下静置15 min 染色。
（6）弃掉结晶紫染色液，用水轻柔地洗孔板三次，吹干。
（7）拍照，用酶标仪检测OD560 度数。
2.2.5.4 alpha 溶血素检测
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）测量OD600 并将不同的菌株调整至OD600 一致。
（3）在羊血平板上分别滴上金葡菌培养物，在37 ℃恒温箱静置培养
24 小时。
（4）观察菌落周围血细胞被溶解后形成的透明环，拍照。
2.2.5.5 胞外蛋白酶实验
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）测量OD600 并将不同的菌株调整至OD600 一致。
（3）在牛奶平板上分别滴上金葡菌培养物，在37 ℃恒温箱静置培养
24 小时。
（4）观察菌落周围牛奶蛋白被溶解后形成的透明环，拍照。
2.2.5.6 万古霉素敏感性实验
平板试验：
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）测量OD600 并调整至CFU 约10
7
个/ml（约OD600=0.05）。
（3）1:10 梯度稀释，并分别涂布置含有不同浓度万古霉素的MH 平板。
（4）37 ℃恒温箱静置培养24 小时。
（5）观察并计数。
液体实验：
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）测量OD600 并调整接种至10 ml MH 培养基，CFU 约10
7
个/ml。
（3）每小时测量各瓶OD600 数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约
12 小时）。
2.2.5.7 葡萄糖-6-磷酸诱导实验
（1）从37 ℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1 ml
TSB 的10 ml 培养管中。
于37 ℃振荡培养（转速220 RPM）过夜。
（2）离心收集，用无菌PBS 清洗三次，调整至OD600=1.0。
（3）1:100 接种至PN 培养基，37 ℃振荡培养（转速220 RPM）6 小时。
（4）向培养物中添加葡萄糖-6-磷酸至终浓度5 g/L，继续培养。
（5）在不同时间点分别收集1 ml 菌液（添加前0 min，添加后1 min， 5 min，30 min），抽提RNA。
2.2.5.8 金黄色葡萄球菌上清AI-2 浓度检测
（1）收集菌液上清。
将1:100 接种的金葡菌每隔固定时间测量OD600 的值
并取菌液，4 ℃离心取上清，保存至-80 ℃待用。
（2）将上清化冻后，分别加样至专用发光检测96 孔板，每孔。
（3）将过夜培养的弧菌BB170 根据发光强度1:5000 到1:10000 稀释，分装
至发光检测板，每孔。
（4）在30 ℃振荡培养，定时使用Veritas 发光检测仪检测发光强度。
（5）对照组发光强度-时间曲线会出现“V”型曲线，取曲线最低点附近，
测量组与对照组发光强度的比值，即可表征AI-2 浓度。