MERS样本的实验室检测-201562

反应条件：
50℃ 95℃ 95℃ 55℃ 30min（逆转录） 5min（热启动） 40循环 15sec（变性） 45sec（退火采光）
反应时间：
1.5-2小时Baidu Nhomakorabea
2015年5月30日 MERS检测试剂盒检测确诊患 者结果
中东呼吸综合征冠状病毒RNA双色检测试剂盒ORF/upE （FAM/VIC） 1 3 4 2
样品编号 ORF （FAM） 阳性对照 咽拭子样 本 CT值 22.58 36.35 样品编号 upE （VIC） 阳性对照 咽拭子样 本 CT值 22.54 33.17
1 2
3 4
2015年5月30日 MERS检测试剂盒检测确诊患 者结果
中东呼吸综合征冠状病毒N基因检测试剂盒N2 （FAM）
1 2
接收单位
地址 负责人
运输方式
专车专运
运输工作 本的人，不要 负责人 写没有参与运 输的领导
职务或 职称
联系 电话
申请运输单位审查意见：
法人代表： 运输单位法人签字
公 章 单位盖章 年 月 日
省、自治区、直辖市卫生行政部门审核意见： 市卫生局审核意见
表格的填写 （二）
卫生部审批意见：
公 章 市卫生局盖章 年 月 日
病死率（9.5%）
4
《人间传染的病原微生物名录》
实验室生物安全
• 1、标本的分装和核酸提取在生物安全二级实验室的生物安全柜内进 行；病毒培养物的核酸提取必须在生物安全三级实验室的生物安全柜 内进行。 2、标本的抗原快速检测以及采用灭活抗原进行ELISA检测血清抗体 时，要求在生物安全二级实验室内操作；采用微量中和试验进行血清 抗体检测应在生物安全三级实验室操作。 • 3、中东呼吸综合征冠状病毒的分离、鉴定和中和实验应在生物安全 三级实验室里进行。 • 4、阳性标本和分离物的保存及销毁应按照《病原微生物实验室生物 安全管理条例》（国务院第424号令）执行。
样品编号 1 2
N2（FAM） 阳性对照 咽拭子样本
CT值 22.81 30.36
分子检测结果分析
1. 病毒核酸的荧光定量检测方法 主要有检测E蛋白上游基因（upE）、ORF1b基因和ORF1a基因三种。这些方法均高度敏感，检测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感， 但比其更加特异。 检测结果判读： 阴性: 无Ct值或Ct为40; 阳性：Ct值<37, 可报告为阳性。 Ct值在37-40之间的样本建议重做, 若重做结果Ct值< 37，该样本判断为阳性, 否则为阴性。 2. RT-PCR扩增RdRp或N 基因后测序检测MERS-CoV RdRpSeq assay:Fragment size: first round : 242bp (including primers), second round 228 bp (including primers) Nseq assay:Fragment size: first round : 306-312 bp (including primers), second round 279-285 bp (including primers) 3.阴性结果 : 一些因素可能产生假阴性，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样 本；技术本身存在的原因，如；病毒变异，PCR抑制等。 当PCR检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是中东呼吸综合征冠状病毒感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足 血清学检测的要求。
标本采集
• 1、采集对象：中东呼吸综合征冠状病毒 感染疑似病例、临床诊断病例及需要进一 步研究的确诊病例；其它需要进行中东呼 吸综合征冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者。
标本采集
• 2、标本采集要求 • 2.1 从事中东呼吸综合征冠状病毒检测标本采集的技术 人员应经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验 技能。在标本采集过程中，采样人员可参照人感染高致病 性禽流感H5N1的防护措施进行安全防护。 • 2.2 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机 构专业人员指导下采集。 • 2.3 密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。
样本包装
《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或 样本运输管理规定》
A类包装 三层包装系统：
初级容器 次级容器 外层包装
初级容器--第一层包装为自封袋或50mL离心管
A类次级容器
12
A类外包装（制冷器件、衬垫材料）
样本包装
传染病医院病区内的区域划分（三区、两道）
三区为：污染区、潜在污染区（半污染区）、清洁 区；两道为医务人员通道、病人通道。 交接流程 （污染区） （半污染区） （清洁区） 初级容器 —— 次级容器 —— 外层包装 （或清洁区）
-准运证的填写
主容器
2ml毒株冻存管
辅 助 容 器
塑 料 罐
填充物
脱脂棉
外包装 拆检注意事项 运输次数及运输日期 运输起点 运输终点
铝制包装箱
制冷剂名 称与数量
4块冰袋
运输途中严禁拆检，达到目的地后小心拆箱，检查罐口有无遗漏
1次．2014年8月26日运输（可以写多次，时间跨度为半年，同申请 表）
XX市XX疾病预防控制中心 济南市山东省疾病预防控制中心 名称 XX市疾病预防控制中心 xxxxxx 分管领导或 科主任 电话 固话和手机均可填 地址 联系人 名称
名称 （中英文） 菌（毒）种或样本 人感染H7N9禽流感 病毒（specimen of human infected H7N9 avian influenza virus） A类/2814
总数 量
每包装容 量
包装数量
样品状态
1管
2ml
1份
液态
分类/UN编号
运输目的
运送至省疾控中心复核
表格填写（四）
运输申请单位
山东省疾病预防控制中心 济南市经十路16992号 分管领导或 电 固话和手机均可填 科主任 话 专车专运 公章 省卫生计生委盖章
接收单位
地址 联系人
运输方式 批准单位
运 输
专车运送。 由专人护送，不得少于两人。 护送人员接受过生物安全培训。
标本保存
• 用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快 进行检测，24小时内能检测的标本可置于 4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置 于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件， 则于-20℃冰箱暂存）。血清可在4℃存放3 天，可在-20℃以下长期保存。标本运送期 间应避免反复冻融，并应设立专库或专柜 单独保存标本。
省卫生计生委审核意见
公 章 省卫生计生委盖章 年 月 日
表格的填写（三）
需要准备的文件（均需打√）
法人资格证明材料（复印件） 接收单位同意接收的证明文件（原件） 接收单位出具的卫生部颁发《从事高致病性病原微生物实验活动实验室资格 证书》（复印件） 接收单位出具的有关政府主管部门核发的从事人间传染的高致病性病原微生 物或者疑似高致病性病原微生物实验活动、菌（毒）种保藏、生物制品生产 等的批准文件（复印件） 容器或包装材料的批准文号、产品合格证书
样本采集种类与要求
•每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本； 应优先采集下呼吸道标本，可根据临床表现与采 集样本的时间间隔决定采集鼻拭子、咽试子；粪 便、血清也应该采集。死亡病例依据《传染病病 人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华 人民共和国卫生部第43号令）中人感染高致病性 禽流感的相关规定采集尸体标本，没有条件进行 尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采 集肺组织标本。 • 3.1 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻 咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。 • 3.2 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气 管灌洗液、肺组织活检标本。 • 3.3 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解 剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸 检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也 可采集肾脏的组织标本。 •3.4 血清标本：每一病例都应尽量采集急性期、 恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发 病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4 周采集。采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议使 用真空采血管。
上送标本
• 检测结果阳性或可疑的原始标本或分离 物应及时送中国疾病预防控制中心复核和 进一步检测；省级疾病预防控制机构实验 室检测阴性，但有明确流行病学证据的病 例标本应送中国疾病预防控制中心进一步 检测。
生物安全
中东呼吸综合征病例标本分装、处理、核酸 检测、血清学检测工作应该在BSL-2级实验室 内进行，病毒分离工作应该在BSL-3级实验室 内进行。
β-2b β-2a β-2c
γ
α
# MERS-CoV=HCoV-EMC
MERS
基因组结构与系统 发生（ β-2c ） 受体为二肽酰肽酶4
（DPP4，也称为CD26）
V. S.
SARS
基因组结构与系统 发生（β-2b） 受体是血管紧张素 转换酶2 (ACE2)
传染性强
有限的人间传染?
高病死率（37%？）
中东呼吸综合征冠状病毒实验 室检测要求
山东省CDC病毒所 李忠 2015-06-02
检测方案制定依据：
《病原微生物实验室生物安全管理条例》 《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》 《人间传染的病原微生物名录》 《医院感染管理规范》
HCoVs 系统发生分析
Fulllength
开展MERS-COV检测的实验室应到当地卫生局有关部门申请实验内容变更。
MERS-CoV感染的实验室分子检测流程(2013）
待 检 样 品 upE 特 异 性 RT-PCR 检 测 其他检测
阳性
阴性
ORF1a 检测 阳性
RT-PCR RdRp测序或N 测序检测 其他序列 阴性
阴性 MERS冠状病毒
携带准运证
名称 （中英文） 菌（毒）种 或样本 人感染H7N9禽流感病 毒标本（specimens of human infected H7N9 avian influenza virus）
分类/ 样品 UN编号 正粘病毒科 /2814 状态
规格及数量 每包装容 量 包装数量
来源
人鼻、咽拭
液态 2 ml 1份 子
• • • • • 5、其他说明：以下活动可在BSL-2实验室进行，按照BSL-2实验室操作方法进行操作： 病理检查、福尔马林固定或组织灭活等；提取核酸物质的分子分析；戊二醛固定后样本的电镜检测； 常规细菌或霉菌培养基检测； 固定样本的染色和显微镜观察； 以下涉及潜在感染样本的操作也应该在BSL-2实验室生物安全柜中进行：稀释样本；接种细菌或霉 菌培养基；进行不涉及病毒繁殖的检测性操作；对可疑感染样本进行核酸提取；对涂片进行化学固 定或热固定处理，然后进行显微镜观察。 以下操作必须在动物BSL-3实验室进行，并且按照动物BSL-3实验室操作要求进行：可疑感染样本 接种动物进行病毒分离；动物接种研究病毒性状的研究。
运输目的 主容器 2ml毒株保存管
运送至省疾控中心复核 辅助容器 塑料罐 制冷剂名称与 数量 填充物 脱脂棉
表格的填写（一） -申请表的填写
外包装 拆检注意事 项 运输起止地 点 运输次数
铝制包装箱
冰袋4块
运输途中严禁拆检，达到目的地后小心拆箱，检查罐口有无遗漏 起点 终点 1次（可以填写多次） 名称 XX市XX疾病预防控制中心 济南市山东省疾病预防控制中心 运输日期 2014年8月26日（多次可以填写半年 时间范围） 山东省疾病预防控制中心 济南市经十路16992号 xxx 最好写运输标 电话 写手机号码 写手机号码 （方便随时能 够联系）
确 诊
中东呼吸综合征冠状病毒单色与双色荧光PCR检测试剂盒
VR-Ⅱ-111 VR-Ⅰ-113
RNA 中东呼吸综合症冠状病毒双色荧光PCR 检测试剂盒 RNA 中东呼吸综合症冠状病毒N基因荧光PCR 检测试剂盒
试剂组成：
反应液1 反应液2 反应液3 待测样本 （buffer） （酶） （Probe） 7.5ul 5ul 7.5ul 5ul
• • • • • • • • • • • • • •
六、临床诊断 （一）疑似病例。 患者符合流行病学史和临床表现，但尚无实验室确认依据。 1.流行病学史。发病前14天内有中东地区旅游或居住史；或与疑似 /临床诊断/确诊 病例有密切接触史。 2.临床表现。难以用其他病原感染解释的发热（体温≥38℃）伴呼吸道症状。 （二）临床诊断病例。 1.满足疑似病例标准，仅有实验室阳性筛查结果（如仅呈单靶标PCR或单份血清 抗体阳性）的患者。 2.满足疑似病例标准，因仅有单份采集或处理不当的标本而导致实验室检测结果 阴性或无法判断结果的患者。 （三）确诊病例。 疑似和临床诊断病例具备下述4项之一，可确诊为中东呼吸综合征实验室确诊病 例： 1.至少双靶标PCR检测阳性。 2.单个靶标PCR阳性产物，经基因测序确认。 3.从呼吸道标本中分离出中东呼吸综合征冠状病毒。 4.恢复期血清中东呼吸综合征冠状病毒抗体较急性期血清抗体水平阳转或呈4倍以 上升高。