单克隆抗体技术个人总结推荐文档
高中生物单克隆抗体实验总结
⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 考试是检测学⽣学习效果的重要⼿段和⽅法，考前需要做好各⽅⾯的知识储备。
下⾯是店铺为⼤家整理的⾼中⽣物单克隆抗体实验总结，希望对⼤家有所帮助! ⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 (⼀)动物的选择 ⽬前应⽤最⼴的是⼩⽩⿏和⼤⽩⿏，尤以⼩⽩⿏为好。
就品系⽽⾔以Balb/c⼩⽩⿏应⽤最⼴，由于所有的⼩⽩⿏⾻髓瘤系均从Balb/c⼩⽩⿏系诱导出来。
Balb/c系⼩⽩⿏必须⽤纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。
⼤⽩⿏也可，能产⽣较多量的单抗体。
现在已经在⼩⿏杂交瘤的基础上，发展了⼩⿏-⼤⿏，⼩⿏-⼈以及⼈-⼈杂交瘤技术。
(⼆)免疫 ⼀般⽽⾔，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
免疫程序、剂量和⽅法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之⼀。
正常⼩⿏脾脏含有能产⽣各种不同抗体的B淋巴细胞，⼀只纯种⼩⽩⿏估计能产⽣1.0×107~5.0×107种不同的抗体。
因此⼀只正常的⼩⽩⿏的脾细胞与⼩⿏⾻髓瘤融合，只能有千万分之⼀的机会获得某⼀种特定抗体。
所以为了进步得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产⽣特异性抗体的B淋巴细胞⼤量增加。
B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很⼤影响。
有⼈以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，⽽免疫以后7~8天，固然是抗体产⽣的⾼峰时期，但形成有活⼒的杂交瘤细胞的可能反⽽减少。
故⼀般以为加强免疫后的第三天应杀⿏取脾做细胞融合。
1.可溶性抗原(蛋⽩质) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗⽒完全佐剂乳化，分多点⼩⿏⽪下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3～5周再同样注射⼀次，10天后，断尾取⾎⼀滴，测抗体效价，选滴度⾼的⼩⿏做融合试验。
⼀个⽉后可以经静脉(尾静脉)给予⽆佐剂抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，杀死⼩⿏取脾做融适⽤。
2.颗粒性抗原如抗原来源⽅便，可以不加佐剂⽽增加免疫次数，缩短间隔时间。
单克隆抗体药物关键技术分析教学总结
单克隆抗体药物关键技术分析1.高通量的动物细胞表达技术一方面，从表达体系来看，近年来，人们不断发展和完善了许多抗体分子的表达体系，如：细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞表达系统和体外翻译系统等。
哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等重要优点，已成为抗体等生物技术产品最重要的系统。
2007年销售额排名前列的6类生物技术药物中，有5类是由动物细胞表达生产（肿瘤治疗抗体类、抗TNF-α抗体类、EPO 类、β干扰素类、凝血因子类），仅胰岛素类药物是由大肠杆菌和酵母表达的。
欧美国家哺乳动物细胞表达产品种类占60%-70%，市场份额占65%以上。
另一方面，从抗体制备规模、速度和功能来看，高通量抗体制备技术的发展十分重要。
哺乳动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术是生物医药产品主要的生产方式和关键“瓶颈”技术。
目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10,000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为0.5-2g/L；我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破。
2.人源化抗体的构建及优化技术随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造。
抗体药物已经进入基因工程抗体时代。
基因工程抗体具有以下优点：①降低人体对异种抗体的排斥反应；②减小抗体的分子量，利于其穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据需要，制备新型抗体；④采用多种表达方式，大量表达抗体分子，降低生产成本。
(1)表面重塑抗体对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。
该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体技术手册
单克隆抗体技术手册一、什么是单克隆抗体技术单克隆抗体技术，简单来说，就是一种能够生产出大量高纯度、高特异性抗体的生物技术。
在生物医学领域，它就像是一把精准的钥匙，能够准确地打开特定疾病的“锁”。
抗体，大家都知道，是我们身体免疫系统产生的用来对抗病原体的“武器”。
但传统方法得到的抗体往往是混合物，纯度不高，特异性也有限。
而单克隆抗体技术则改变了这一局面。
二、单克隆抗体技术的原理要理解单克隆抗体技术，得先从免疫系统说起。
当我们的身体受到病原体入侵时，免疫系统中的 B 淋巴细胞会被激活，产生抗体来对抗病原体。
每个 B 淋巴细胞产生的抗体都略有不同。
单克隆抗体技术的核心就是要从众多的 B 淋巴细胞中，筛选出一个能够产生我们所需要的特定抗体的细胞。
这个过程就像是在大海里捞针。
首先，将抗原（比如某种疾病的蛋白质）注射到小鼠体内，让小鼠的免疫系统产生反应。
然后，从小鼠的脾脏中取出产生抗体的 B 淋巴细胞。
接下来，将这些 B 淋巴细胞与一种能够无限增殖的骨髓瘤细胞融合。
这一步非常关键，因为骨髓瘤细胞可以不停地分裂生长，而 B 淋巴细胞能够产生抗体。
融合后的细胞就兼具了两者的优点，既能产生抗体，又能无限增殖。
然后，通过特定的筛选方法，找出那些能够产生我们所需要的抗体的融合细胞。
这些细胞就是单克隆抗体的“源头”。
三、单克隆抗体技术的步骤1、免疫动物选择合适的动物（通常是小鼠），给它们注射特定的抗原，激发免疫系统产生抗体反应。
2、细胞融合将免疫后的动物脾脏细胞（包含产生抗体的 B 淋巴细胞）与骨髓瘤细胞在一定条件下进行融合。
3、筛选与克隆使用特定的培养基和检测方法，筛选出能够产生目标抗体的融合细胞。
然后对这些细胞进行克隆培养，得到大量相同的细胞。
4、抗体的提取与纯化从培养的细胞上清液或细胞内提取抗体，并通过一系列的纯化方法，去除杂质，得到高纯度的单克隆抗体。
四、单克隆抗体技术的应用1、疾病诊断单克隆抗体可以特异性地识别疾病相关的标志物，用于疾病的早期诊断。
单克隆抗体的优点及应用
单克隆抗体的优点及应用单克隆抗体指的是在体外培养中由单个克隆细胞产生的抗体，具有以下优点：1. 高度特异性：单克隆抗体只能识别和结合特定的抗原，从而实现高度特异性的识别分析。
这种高度特异性使得单克隆抗体在医学诊断、生物学研究和治疗中具有重要作用。
2. 高度稳定性：单克隆抗体经过长时间体外培养定向生产，具有较高的稳定性和一致性。
相比多克隆抗体，单克隆抗体的生产工艺更加可控，能够规避批次间的变异性。
3. 丰富的供应来源：单克隆抗体可以通过体外培养细胞的方式进行生产，而不依赖于动物体内免疫。
因此，可以实现大规模、高效率的抗体生产，并且能够满足临床和科研的需求。
4. 可调控的亲和力：通过对单克隆抗体的序列进行修饰和工程化，可以实现对其亲和力的调节。
这使得单克隆抗体在不同应用中，如免疫检测、药物传送和治疗等方面具有更高的灵活性。
单克隆抗体在各个领域都有广泛的应用：1. 临床诊断：单克隆抗体可用于各种免疫检测和诊断方法中，如ELISA、免疫荧光、免疫组织化学等。
例如，单克隆抗体可以用于检测特定癌细胞标志物，帮助早期诊断癌症，并监测疾病治疗的疗效。
2. 疾病治疗：单克隆抗体可以作为治疗药物，用于疾病的预防和治疗。
例如，单克隆抗体可以用于免疫疗法，通过结合特定抗原靶点来激活免疫系统，以治疗疾病如癌症、风湿性关节炎等。
3. 药物研发：单克隆抗体可用于药物研发的多个环节。
首先，通过单克隆抗体的选择，可以筛选出特定靶点的抗体药物。
其次，单克隆抗体也可用于药物的毒性测试和临床试验的监测，为药物的研发提供重要的技术支持。
4. 生物学研究：单克隆抗体在生物学研究中具有广泛的应用。
例如，可以利用单克隆抗体来研究特定蛋白质的功能、表达和定位。
此外，还可以利用单克隆抗体进行细胞或组织样本的免疫荧光染色，以实现对细胞和组织结构的分析。
5. 农业和食品安全：单克隆抗体也可以应用于农业和食品安全领域。
例如，可以利用单克隆抗体来检测和监测农业有害生物，或者检测食品中存在的有害物质和污染物。
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术（Monoclonal antibody technology）是一种利用体外细胞融合技术制备大量拥有相同特异性的抗体的方法。
该技术第一次成功地于1975年由科学家科尔和米尔斯坦开发，并获得了1984年的诺贝尔生理学或医学奖。
单克隆抗体技术已经成为生物医学研究、药物开发和诊断等领域中重要的工具。
单克隆抗体与多克隆抗体相比，具有以下几个显著优势：首先，单克隆抗体具有高度特异性。
多克隆抗体是由多个B淋巴细胞分泌的抗体混合物组成，因此可能具有各自不同的特异性。
而单克隆抗体则由同一种B淋巴细胞克隆分裂形成，具有相同的特异性。
这种高度特异性使得单克隆抗体在抗原检测和治疗方面具有更高的准确性和效能。
其次，单克隆抗体具有高度稳定性。
传统的多克隆抗体的产生是通过免疫动物，如小鼠或兔子，激发抗原，因此有可能引起免疫动物自身的免疫反应。
这种反应可能降低多克隆抗体的稳定性。
然而，单克隆抗体技术是在体外进行的，不需要使用动物，因此不会出现这种问题。
单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：1. 免疫原的制备：根据需要，可以制备多种类型的免疫原，如蛋白质，多肽，糖类或小分子化合物。
免疫原的选择取决于需要检测或治疗的目标。
2. 免疫动物的免疫：在选择的免疫动物（如小鼠）体内注射免疫原，以激发免疫动物产生特异性抗体。
通常，需要多次免疫来促使免疫系统产生足够高水平的抗体。
3. 脾细胞的提取：在适当的免疫时间点，收集免疫动物的脾脏，以提取免疫细胞。
这些细胞包括深受影响的B淋巴细胞，它们是产生抗体的主要来源。
4. 囊泡瘤细胞的提取：选择特定的肿瘤细胞系，如骨髓瘤细胞系，来提取囊泡瘤细胞。
囊泡瘤细胞有一种特殊的能力，即在长时间无限次的分裂中保持产生抗体的能力。
5. 细胞融合：将免疫细胞和囊泡瘤细胞以一定比例混合，并使用聚乙二醇等融合剂在体外将其融合成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞继承了免疫细胞的抗体产生能力和囊泡瘤细胞的无限次分裂能力。
单克隆抗体工作总结怎么写
单克隆抗体工作总结怎么写单克隆抗体工作总结。
单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，由单一的B细胞克隆产生，具有一致的抗原结合特性。
它们在医学、科研和生物制药领域发挥着重要作用，为疾病诊断、治疗和疫苗研发提供了有力支持。
单克隆抗体的工作原理主要包括以下几个步骤：
1. 抗原筛选，选择目标抗原并进行筛选，以获得特异性高的单克隆抗体。
2. B细胞克隆，从免疫动物中获取B细胞，并通过细胞融合技术获得单克隆抗体生产的细胞株。
3. 抗体表征，对单克隆抗体进行亲和力、特异性和稳定性等方面的表征。
4. 应用开发，将单克隆抗体应用于疾病诊断、治疗和生物制药等领域，如药物研发、肿瘤治疗和疫苗生产等。
单克隆抗体的工作总结可以从以下几个方面展开：
首先，介绍单克隆抗体的基本原理和工作流程，包括抗原筛选、B细胞克隆、抗体表征和应用开发等内容。
其次，总结单克隆抗体在疾病诊断和治疗中的应用，如肿瘤标志物检测、免疫治疗和药物靶向等方面的进展。
最后，展望单克隆抗体在未来的发展趋势和应用前景，如个性化医疗、精准药物和新型疫苗等方面的潜在应用。
总之，单克隆抗体作为一种重要的生物制药工具，在医学和科研领域具有广阔的应用前景，其工作总结将有助于推动其在临床和生产中的更广泛应用。
单克隆抗体的制备及应用心得体会200字
单克隆抗体的制备及应用心得体会200字单克隆抗体既具有高度均一性、同时又具有针对性。
由于单克隆抗体的制备方法是杂交瘤技术，所以，研究的动物对象不需要不断地进行免疫。
为此单克隆抗体技术受到现代科技青昧和世人嘱目。
因此，在高中生物中给学生介绍一些单克隆抗体技术及应用，有利于诱导他们对生命科学的探究，也有利于他们形成生物科学发展的核心素养。
很多人因疾病而备受煎熬，疾病是人类的“天敌”，人类无时无刻不在对疾病的预防和治疗进行科学研究。
众所周知，现在最大的杀手“肿瘤”疾病的治疗成为生命科学的重要研究对象。
当今，科研人员采用单克隆抗体技术对疾病进行治疗进展显著，其中将单克隆抗体同药物的藕联，然后与病原体或肿瘤的特异抗原结合技术起到很好的疗效，并成为常态。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
单克隆抗体技术个人总结制备单克隆抗体1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案：初次免疫 1 X 10 7/ 0.5ml ip （腹腔内注射）J 2〜3周后第二次免疫 1 X 10 7 /0.5ml ipJ 3周后加强免疫（融合前三天）1 X 107/0.5ml ip或iv（静脉内注射）取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫Ag〜50 ^g加福氏完全佐剂皮下多点注射I （一般0.8 〜1ml 0.2ml/点）J 3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ipI （ip剂量不宜超过0.5ml）J 3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ipI （5〜7天后采血测其效价，检测免疫效果）J 2〜3周后加强免疫，剂量50〜500 ^g宜，ip或ivJ 3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
（二）饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/ c小鼠6〜10周龄拉颈处死浸泡于75%酒精，消毒3〜5分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入6〜8ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转/分离心5〜6分钟用20 %小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数 1 X05 / ml加入96孔板，100卩/孔放入37 C CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5〜8X 106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5 X 106/ ml，小鼠脾细胞为1 X 106/ ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1 X 105/ ml，均为100卩/孔。
（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640 , DMEM 培养基。
小牛血清的浓度一般在10〜20%,细胞的最大密度不得超10 6/ ml, 一般扩大培养以1 : 10稀释传代，每3〜5天传代一次。
细胞的倍增时间为16〜20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3〜6月应用8〜AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 %，也是决定细胞融合的关键。
（四）免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较咼。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2X 10 8左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤(一) 细胞融合流程⑴取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0, 1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1 : 10或1 : 5的比例混合在一起，在50ml料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6) 在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml45 % PEG(Merek,分子量4000)含5% DMSO，边加边搅拌。
②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml, 2ml, 3ml, 4ml , 5ml 和10ml。
(7) 离心，800rpm, 6 分钟。
(8) 弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml 一块96孔板。
(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100卩/孔，37 C、5 % CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1 X107脾细胞。
(二) HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。
HT和HAT均有商品化试剂50 X贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200卩/孔。
所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。
我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50 X HATH: 5X 10-3MA: 2X 10-5MT: 8X 10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。
一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有:1. ELISA 用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb 的检测。
2. RIA 用于可溶性抗原、细胞McAb 的检测。
FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4. IFA 用于细胞和病毒McAb 的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
犚r 为经过HAT 筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
（一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1. 有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1〜5X 103/ ml③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ ml, 100^/孔加A、B、C 三排为每孔2 个细胞。
余下2.9ml 细胞悬液补加2.9ml 含饲养细胞的完全培养液, 细胞数为10个/ ml, 100^1孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。
余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ ml, 100^/孔，力口G、H排，为每孔0.5 个细胞。
④培养4〜5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200^1孔。
⑤第8〜9 天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT 。
2. 软琼脂法①软琼脂的配制含20% FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401 %琼脂水溶液：高压灭菌，42 C预热。
0.5%琼脂：由份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。
置42C保温。
②用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100/ ml, 500/ml或5000/ ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1ml 0.5 %琼脂液（42 C预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37C, 5%CO2 孵箱中。
⑥4〜5天后即可见针尖大小白色克隆，7〜10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦ 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
（二 ） 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、 每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。
因为在没 有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候， 细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、 分 泌抗体能力的丧失等等。
如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含 1 X106 以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在 当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。