聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用
蛋白质的分离纯化方法一
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
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范树国
普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
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范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
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范树国
（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
聚乙二醇生产技术及其在医药领域中的应用
聚乙二醇生产技术及其在医药领域中的应用1. 引言1.1 概述聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）是一种重要的高分子聚合物，由乙二醇单体通过聚合反应制得。
它具有许多优异的性能和广泛的应用领域，尤其在医药领域中具有重要意义。
本文旨在对聚乙二醇的生产技术及其在医药领域中的应用进行综述。
1.2 聚乙二醇的研究背景自20世纪初人们开始对聚乙二醇进行研究以来，其在材料科学、化学工程和生物医学等领域逐渐受到了广泛关注。
因其独特的结构和多样化的功能化修改方法，聚乙二醇在药物传输、生物材料、诊断试剂等方面展现出巨大潜力，并成为当前研究热点之一。
1.3 研究意义聚乙二醇作为一种生物相容性良好且可调控性强的聚合物，在医药领域中已经取得了许多实质性进展。
它可以被用作药物载体，帮助提高药物的稳定性和生物利用度；还可以制备医用材料，扩大其应用范围和功能性；同时也可用于构建药物传递系统，实现针对性和控释性药物输送。
因此，在深入研究聚乙二醇的生产技术及其在医药领域中的应用前景方面，具有重要的科学意义和应用价值。
以上是本文“1. 引言”部分的内容，通过对聚乙二醇概述、研究背景以及研究意义进行介绍，为读者提供了阅读该文的基本背景信息。
接下来，本文将详细介绍聚乙二醇的生产技术以及在医药领域中的应用情况。
2. 聚乙二醇的生产技术：2.1 合成原理：聚乙二醇（Polyethylene Glycol，简称PEG）是一种由乙二醇分子通过缩合反应形成的聚合物。
其合成原理是通过将乙二醇中羟基（-OH）与羧基（-COOH）或羧酸衍生物反应，进而生成较长链的聚合物。
2.2 制备工艺：聚乙二醇的制备工艺主要包括以下步骤：(1) 首先将纯净乙二醇加热至一定温度，使其转化为气体状态；(2) 将气态乙二醇引入到催化剂床层中，在适当的催化剂作用下进行反应；(3) 反应过程中需要控制温度和压力等条件，以确保反应能够高效进行；(4) 经过一系列反应后，得到目标产品聚乙二醇；(5) 进行后续的提取、纯化和干燥等处理步骤，得到符合要求的聚乙二醇产品。
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术简介近年来，随着蛋白质药物的聚乙二醇修饰技术的发展，聚乙二醇化药物得到了广泛的应用。
目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市，临床医疗效果优异，市场上也表现出了良好的业绩。
同时还有数十种聚乙二醇化蛋白质药物处在临床或临床前研究阶段。
聚乙二醇简介聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）是一类聚醚类聚合物。
随着平均分子量的不同，性质也产生差异。
当分子量小于1000 Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是白色固体。
固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。
聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。
聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106 Da，本身的免疫原性也很低。
临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗时，未发现抗聚乙二醇抗体产生。
聚乙二醇是经美国食品药品管理局（FDA）批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。
聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（pegylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。
将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。
聚乙二醇修饰反应类型在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。
活化的聚乙二醇通过与蛋白质分子上的氨基酸残基进行化学反应而实现与蛋白质的偶联。
这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>ε-氨基>羧基（羧酸盐）>羟基。
peg沉淀免疫球蛋白原理
peg沉淀免疫球蛋白原理
PEG沉淀是一种可以用于纯化免疫球蛋白的方法。
PEG是聚乙二
醇的缩写，它可以通过沉淀的方式将免疫球蛋白从混合物中分离出来。
PEG分子的作用是引起免疫球蛋白分子之间的交互作用，从而形成沉淀团。
这些沉淀团随后可以被离心分离出来并通过洗涤和再溶解后获得
纯化的免疫球蛋白剂量。
PEG沉淀的原理是基于三种作用机制：1）体积排斥效应；2）疏
水作用；和3）电荷中性化。
PEG可以和免疫球蛋白分子之间形成疏水区，引起球蛋白分子之间的体积排斥效应，从而导致球蛋白分子形成
复合体。
同时，PEG分子也会中和免疫球蛋白的电荷，从而进一步促成沉淀反应。
在实践中，PEG沉淀技术的优点之一是简单易行且具有成本效益。
与其他纯化技术相比，减少蛋白质损失的同时同时可以高效纯化免疫
球蛋白。
PEG沉淀技术已经被广泛应用于生物制药和医学领域，包括从人血清、小鼠清蛋白和细胞培养液中纯化特定的免疫球蛋白种类。
总的来说，PEG沉淀技术是一种可靠有效的纯化免疫球蛋白的方法，可以帮助实现高效且低成本的纯化目的。
peg修饰蛋白 实验步骤
peg修饰蛋白实验步骤
修饰蛋白是指通过化学或生物方法改变蛋白质的结构或功能。
PEG（聚乙二醇）是一种常用的修饰剂，可以用于增加蛋白质的稳定性、溶解性和可溶规模等。
以下是用PEG修饰蛋白的实验步骤的一般流程：
1. 准备实验材料和试剂：包括蛋白质、PEG修饰试剂、缓冲液、还原剂、凝胶电泳等。
2. 确定实验方案：确定蛋白质的修饰条件，包括PEG修饰剂的浓度、反应时间和温度等。
3. 准备修饰反应体系：将蛋白质加入合适的缓冲液中，并加入适量的PEG修饰试剂。
4. 进行PEG修饰反应：将蛋白质和PEG修饰试剂混合，使其在适当的反应条件下进行修饰反应。
5. 控制修饰反应的时间和温度：根据所需的修饰程度，控制修饰反应的时间和温度，一般在室温下进行。
6. 终止修饰反应：通过添加适当的试剂终止修饰反应，如还原剂。
7. 分离和纯化修饰蛋白：可使用凝胶电泳、柱层析、过滤等方法将修饰后的蛋白质分离和纯化。
注意事项：
- 实验过程中需注意实验条件的控制，如温度、pH值等。
- 选择合适的PEG修饰试剂，根据具体实验需求进行选择。
- 在实验设计中考虑到后续操作，如修饰后的蛋白质使用于何种实验或应用。
这只是一个大致的实验流程，具体步骤可能会因实验目的、蛋白质特性等有所变化。
因此，在进行实验之前，最好参考相关文献并根据实验需求进行具体的实验设计和优化。
蛋白质的沉淀与结晶
蛋白质的沉淀于结晶摘要：文章重点阐述了关于蛋白质分离纯化中的沉淀与结晶这两种方法。
通过分别对这两种方法的概念、原理以及操作的中的一些注意事项的阐述，使蛋白质分离工作者可以有一个较全面的参考。
关键词：蛋白质沉淀结晶1.沉淀沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀技术操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
沉淀的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
下面介绍几种蛋白质沉淀的方法：1.1.中性盐沉淀中性盐沉淀是在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程，称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。
1.1.1.中性盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
常用技术有：１、沉淀，２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
４、层析：a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
编辑本段蛋白质分离纯化技术蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。
3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。
peg6000沉淀蛋白质实验步骤
一、简介PEG6000（聚乙二醇6000）是一种常用的蛋白质沉淀剂，可用于富集蛋白质样品。
通过PEG6000沉淀，可以去除混杂物并集中目标蛋白质，有利于进一步的实验分析。
在蛋白质实验中，PEG6000沉淀蛋白质的步骤非常重要，下面将介绍具体的实验步骤。
二、实验步骤1. 样品制备需要准备好含有目标蛋白质的样品。
样品可以是细胞组织、细胞培养上清液等，其蛋白质含量应尽量高纯度。
如果是组织样品，需要先将组织打碎并加入相应的裂解液进行细胞膜的破碎，以释放蛋白质。
2. PEG6000沉淀（1）配置沉淀液取出PEG6000粉末，将适量的PEG6000加入去离子水中，充分溶解，配置成一定浓度的PEG6000沉淀液。
一般情况下，PEG6000的最终浓度在10至20之间。
（2）样品处理取相应的样品，加入刚才配置好的PEG6000沉淀液中，充分混合。
（3）沉淀蛋白质将加入沉淀液的样品在4℃下静置一段时间（通常为30分钟至1小时），让其中的蛋白质沉淀下来。
3. 蛋白质回收使用高速离心机将混合液进行离心分离，将上清液（包含目标蛋白质）完全吸出，离心过程中要注意避免沉淀物的干扰。
将上清液转移到一个新的离心管中。
4. 洗涤和纯化将上清液进行洗涤，可以使用盐溶液（如盐含量为0.1M的NaCl溶液）进行洗涤，去除其中的杂质。
洗涤后的上清液可以用于后续的蛋白质分析或其他实验操作。
5. 实验后处理清洗实验用具，将剩余的样品和试剂妥善保存；记录实验步骤和结果，做好实验记录。
三、注意事项1. 实验操作应在洁净实验室中进行，尽量避免杂质的干扰。
2. 在实验过程中，应严格按照操作规程进行，避免实验条件的变化对结果的影响。
3. PEG6000沉淀实验后的蛋白质，应及时进行后续的分析操作，避免冻融循环影响蛋白质的稳定性和活性。
以上就是使用PEG6000沉淀蛋白质的实验步骤。
通过这些步骤，可以有效地去除混杂物，提高蛋白质的纯度和浓度，为后续的实验操作提供了可靠的样品。
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聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用
摘要：本课题将对聚乙二醇在蛋白质纯化中的作用、优势、应用范围及对于性质鉴定的影响等方面进行研究，为从生物体中提取活性蛋白质组分提供更好的方法和思路，并为聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用提供依据。
关键词：聚乙二醇;球蛋白; 清蛋白
Abstract: In this thesis, PEG used in protein purification will be studied it’s function, advantage , application scope and other aspects. From these facts , It can provide better way and better thinking in extracting protein alive ,and also offer basis of purification.
Key words: polyethylene Glycol , globulin,albumin
1 材料和方法
1.1材料
5%卵清蛋白溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）为自己所配制的溶液；紫外扫描光谱仪Lambda17型（PERKIN-ELMER公司）；荧光分光光度计LS50B型（HITACHI公司）；FTIR谱仪NEXUS670型（Nicolt公司）；其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1不同沉淀蛋白质方法的比较，即用硫酸铵的盐析法；用乙醇的有机溶剂沉淀法；用聚乙二醇的有机溶剂沉淀法和用5%三氯乙酸的有机酸沉淀法
1.2.2 产物性质鉴定用紫外光谱比较法和红外光谱比较法
2 结果与分析
2.1 用聚乙二醇提纯蛋白质不需要考虑盐浓度、PH,甚至蛋白质的绝对溶解度（在水中）等因素(
即三者对于用聚乙二醇提纯蛋白质来说影响不大).
2.1.1证明蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度无关
不同盐浓度卵清蛋白溶液（硫酸铵）直接加入聚乙二醇
不同盐浓度卵清蛋白溶液（硫酸铵）用聚乙二醇反透析比较
注：反透析法就是把聚乙二醇放在透析袋中，让水能进出透析袋中，而蛋白质不能进出透析袋.
结果：在试管底都出现乳白色絮状沉淀，沉淀的量如上面的表格所示,其波动值
结果：在试管底都出现乳白色絮状沉淀，沉淀的量如上面的表格所示,沉淀的量基本相等，加水后能继续溶解(证明其未变性).
2.1.3证明蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与蛋白质的绝对溶解度无关(注:本实验的基础是建立在《基础生物化学实验》第136页实验结果的基础上的.)
溶解度不同的蛋白质溶于聚乙二醇，根据其盐析所需要硫酸铵的量的不同，证明其球蛋白与清蛋白溶解度不一样。
反透析法析出的蛋白质，再溶解，盐析，析出的顺序和5%卵清蛋白溶液盐析析出顺序相同。
结果：球蛋白为白色沉淀，清蛋白为乳白色絮状沉淀（把上清液倒出，然后加水再溶解，再加为分级沉淀。
盐析法先把溶液加到半饱和时，析出的是球蛋白，然后加到饱和时，析出的蛋白质为清蛋白。
）
2.2证明聚乙二醇有保护蛋白质的功能
(1) 一般认为析出后加水能继续溶解的蛋白质，是没有变性的.
(2) 检验蛋白质是否变性的方法可有: ①结晶比较，最可靠，但比较难的到
晶体
②再溶解，简单，但不一定可靠
(3) 分别用硫酸铵、乙醇、聚乙二醇和5%三氯乙酸分别对5%卵清蛋白溶液进行蛋白质沉淀并对比该组反应
结果：加入硫酸铵得到沉淀物，加水后能继续溶解。
加入乙醇的溶液上方变为白色，加水后不能继续溶解
加入聚乙二醇的一次性沉淀，沉淀物加水可继续溶解
加入5%三氯乙酸的为白色沉淀，加水不溶解
3．讨论
聚乙二醇广泛的应用范围：
3.1聚乙二醇对可溶性高分子化合物的修饰作用:
聚乙二醇作为可溶性高分子化合物可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。
如聚乙二醇修饰天冬酰胺酶、尿激酶，修饰过的酶在血液中的半衰期无一例外的成几倍，几十倍的增长，抗原性消失，耐热性提高，并具有耐酸性、碱性和抗蛋白酶的作用。
3.2在细胞融合当中的作用:
把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（淋巴细胞）在聚乙二醇的介导下发生融合。
参考文献:
1、《生物化学》第二版沈同王镜岩主编196-225, 166-168
2、《细胞生物学》第一版翟中和丁明孝王喜忠主编69
3《基础生物化学实验》第二版王秀奇秦淑媛高天慧颜卉君主编135-138
4、《生物化学》第三版王镜岩主编345
5、颜平，苏雅娴，林克椿等。
付立叶变红外光谱法研究短杆菌肽A及其在脂双层中加Na+前后的构象变化[J]生物物理学报.1995,11:490-495。