RNA-SEQ原理及应用解析PPT课件
RNA-seq技术原理及应用-课件PPT
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
rna-seq的原理及应用
RNA-seq的原理及应用1. RNA-seq简介RNA-seq（RNA sequencing）是一种高通量测序技术，用于研究转录组（transcriptome）中的RNA分子。
通过RNA-seq，可以获得细胞或组织中所有转录的RNA序列信息，包括mRNA、ncRNA和小RNA等各种类型的RNA。
RNA-seq技术在生物医学研究、分子生物学和基因组学中具有重要的应用价值。
2. RNA-seq的原理RNA-seq的原理基于Illumina测序技术，主要包括以下步骤：2.1 样本准备样本准备是RNA-seq实验的关键步骤。
通常需要从细胞或组织中提取总RNA，并进行质量控制。
然后使用DNA逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA转录为cDNA。
cDNA可用于进一步测序处理。
2.2 测序文库构建在测序文库构建过程中，需要对cDNA进行片段化（fragmentation）和连接测序适配体（sequencing adapter）等处理。
这些处理步骤是为了生成适合于测序的DNA文库。
2.3 测序构建好的文库可以通过高通量测序技术进行测序。
Illumina测序技术通过将文库中的DNA片段固定在测序芯片上，并进行DNA合成和荧光信号读取，最终得到原始的测序数据。
2.4 数据处理和分析得到原始的测序数据后，需要对数据进行质控（quality control）、去除适配体序列（adapter trimming）、序列比对（sequence alignment）等处理。
最终得到基因表达量或转录本的相对丰度信息，以及差异表达基因等分析结果。
3. RNA-seq的应用RNA-seq技术在生物医学研究中广泛应用，具有以下几个主要应用方向：3.1 基因表达分析RNA-seq可以用于分析细胞或组织中的基因表达模式。
通过测定各个基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达量，可以描述基因表达的时空特征，并进一步挖掘基因的功能和调控网络。
RNA-SEQ原理及应用
差异表达基因的鉴定
差异表达基因的鉴定是指通过比较不同条件或状态下基因的表达水平，找出表达有显著差异的基因。
这些差异表达基因可能涉及到特定的生理或病理过程，通过对这些基因的深入研究，有助于发现新的 药物靶点或疾病标记物。
疾病预后评估与预测
预后评估
通过rna-seq技术对患者的基因表达谱进行分析，可 以评估疾病的预后情况，为临床医生制定治疗方案提 供参考。
预测复发风险
rna-seq技术可以预测肿瘤等疾病的复发风险，有助 于临床医生制定更加合理的随访计划和干预措施。
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转录本组装
将测序得到的短读段组装成完整的转录本序 列，有助于理解基因的表达和调控机制。
基因结构变异分析
基因结构变异
rna-seq可以检测到基因结构变异， 包括基因融合、倒位、易位等。
变异分析
通过对测序数据的深度分析，可以鉴 定出基因结构变异，并研究其对基因 表达和功能的影响。
基因融合检测
基因融合
该技术利用了下一代测序技术，将RNA样本进行逆转录处理，生成cDNA，再通过测序获得每个基因的 序列信息。
rna-seq技术可以检测到低丰度的转录本，并且能够精确地定量基因表达水平，为研究基因的表达调控 提供了有力工具。
rna-seq技术流程
逆转录
将RNA信息。
样本准备
提取样本中的RNA、 PCR扩增等步骤，构建测序文 库。
数据处理
对测序数据进行质量控制、序 列比对、基因表达量计算等处 理。
rna-seq技术的优势与局限性
RNA-seq技术原理及应用[优质ppt]
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3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段在 特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-seq。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
二、RNA板扩增
序列组装和比较
图像获得和处理
TGCT…
1234
TTTT…
簇序列读取反应
二、RNA-seq技术原理
RNA-seq实验流程图
三、RNA-seq结果分析
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
rna-seq测序原理
rna-seq测序原理
RNA-seq测序是一种可以用于研究基因组学、组学、转录组学等领域的测序技术。
它可以用来研究基因的表达模式、基因的功能和蛋白质的表达，以及物种特异性的基因组变异。
RNA-seq是一种高通量的测序技术，可以同时测量数以万计的基因，并识别基因组中的差异，从而获得更多的信息。
它可以被用来研究物种之间的差异，以及物种内部基因表达的变化。
RNA-seq的原理是利用涉及多种步骤的流程，即从RNA
到DNA的反转录编码，然后经过克隆和序列测定，最后分析
和解读。
首先，将RNA制备好，然后进行反转录编码，将RNA转换成DNA，从而产生cDNA（反转录聚合酶）库。
然后，将cDNA库进行克隆，以获得可复制和测序的cDNA片段。
最后，将这些cDNA片段进行序列测定，并通过相应的
软件和算法来解读序列，最终得到RNA-seq的结果。
RNA-seq测序技术具有高通量，高灵敏度，低成本等优点，可以更有效地研究基因组学、转录组学和组学等领域，为基因组学、转录组学和组学研究提供有价值的信息。
rnaseq原理
rnaseq原理RNA-seq是一种广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术，可以用于揭示转录组的全面信息。
本文将介绍RNA-seq的原理、方法和应用。
一、RNA-seq原理RNA-seq的原理基于测序技术，通过将RNA样本转录成cDNA，然后进行高通量测序，最后利用计算方法分析测序结果。
具体步骤如下：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA等各种类型。
2. RNA片段化：将提取的RNA进行片段化处理，通常采用酶或碱性水解等方法。
3. cDNA合成：利用反转录酶将片段化的RNA转录成cDNA，其中可以选择引入barcode或UMI等标记，用于区分不同样本或纠正测序误差。
4. 文库构建：将cDNA进行末端修复、连接接头、PCR扩增等步骤，构建文库。
5. 高通量测序：使用高通量测序技术对构建好的文库进行测序，通常采用Illumina测序平台。
6. 数据分析：对测序产生的原始数据进行质控、比对到参考基因组、表达量计算、差异表达分析等一系列的数据分析步骤。
二、RNA-seq方法1. 转录组测序：全转录组测序是最常见的RNA-seq方法，旨在全面分析细胞或组织中的所有转录本。
这种方法可以发现新的转录本、揭示基因调控网络等。
2. 亚转录本测序：亚转录本测序是一种针对转录本的特定区域进行测序的方法，可以研究剪接异构体、外显子区域等细节信息。
3. 单细胞转录组测序：单细胞转录组测序是一种能够对单个细胞进行转录组分析的方法，可以揭示细胞间的差异和异质性。
三、RNA-seq应用1. 基因表达分析：RNA-seq可以计算基因的表达量，通过比较不同样本之间的表达量差异，可以发现差异表达基因，从而研究基因调控与疾病发生的关系。
2. 剪接异构体分析：RNA-seq可以揭示转录本的剪接异构体，即同一基因在不同组织或发育阶段中产生的不同转录本，有助于理解基因功能的多样性。
3. RNA编辑分析：RNA-seq可以检测RNA的编辑现象，即RNA 分子中碱基的改变。
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
rna-seq原理
rna-seq原理RNA-seq（RNA序列）是一种用于检测和测量转录组中的RNA分子数量和种类的高通量测序技术。
与传统的微阵列技术相比，RNA-seq能够提供更高的分辨率和更广泛的检测范围，因此已成为了转录组学研究的常用技术之一、RNA-seq的原理基于第二代测序技术，包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM和Roche 454等。
RNA-seq 测序过程可以分为样品准备、转录本测序和数据分析三个主要步骤。
样品准备：在RNA-seq实验中，需要从细胞或组织中提取总RNA，并分离出mRNA。
mRNA中包含了转录组的绝大部分信息，因此mRNA选择性地被转录成cDNA，以获取转录本的信息。
在这一步骤中，可以使用磁珠或柱提取和纯化总RNA，并使用亲和性纯化方法获得纯净的mRNA。
转录本测序：经过mRNA纯化后，mRNA通过反转录酶将其转录成cDNA，并合成双链DNA。
可以根据需求选择合适的反转录和合成方法，如Oligo(dT)引物、随机引物和增强式选择性反转录等。
之后，cDNA片段会经过末端修饰和连接接头的添加，然后扩增，并通过PCR进行文库构建。
构建完成的文库会经过质检，确定文库的质量和浓度。
最后，将文库放入测序仪中进行高通量测序。
RNA-seq常用的测序技术是Illumina HiSeq，它可以产生较短的读长，但产量高、错误率低。
数据分析：通过测序仪输出的测序数据，我们可以得到大量的短序列（reads），这些序列需要经过一系列的分析才能得到有关转录本的详细信息。
在数据分析过程中，可以进行基因注释、基因表达定量和差异表达基因分析等。
具体的步骤包括读长修剪、低质量序列过滤、序列比对和计数、基因注释、转录本表达定量和差异分析等。
在RNA-seq分析中，序列比对是一个重要的步骤。
根据测序数据的片段长度，调整对转录组的比对策略。
基于比对的方法有两种：单端比对和双端比对。
单端比对只使用单条序列进行比对，而双端比对则利用测序时同时获得的两个片段进行比对。
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2020/1/1
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• 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万 读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
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高通量测序
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指 能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定， 每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。
• 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文 献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin g)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种 的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又 被称为深度测序(deep sequencing)。
所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对
ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。
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二、RNA-seq技术原理
RNA-seq 实验流程图
首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还 是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理
好的RNA再进行片段化最后用新一代高通量测序 依进行测序。
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三种高通量测序技术的优缺点
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高通量测序中重要名词解释
• 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深 度为10×。
• 2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因 组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接 组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。
• 其中，total exon reads指映射到某个基因上的reads数，mapp ed reads指map到所有基因的总的reads数。
• RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化， 使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值 具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。
RNA-seq技术原理及应用
报告人：柳晓东 2012.4.16
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• 1、RNA-seq技术简介 • 2、RNA-seq技术原理 • 3、RNA-seq技术优势 • 4、RNA-seq技术应用 • 5、RNA-seq发展前景
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、RNA-seq技术简介
RNA-Seq(RNA sequencing)， 即 RNA测序又称转录组测序，就是把 mRNA，smallRNA和 non-coding RNA （ncRNA）全部或者其中一些用高 通量测序技术进行测序分析的技术。
非编码RNA(ncRNA)主要包括有以下几种：转运RNA(tRNA)， 核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(s noRNA)，细胞质小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnR NA)及小RNA (microRNA,miRNA)等。
非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响， 对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至 对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。
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三种高通量测序简介：
• 自2005年以来,以 Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测 序技术相继诞生。之后Helicos Biosciences公司又推出单 分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。
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SAGE, serial analysis of gene expression, 基因表达系列分析 MPSS, massively parallel signature sequencing, 大规模平行信号测序
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四、RNA-seq技术应用
• 1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰富基因注释 的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、UTRs区域鉴定以及 新的转录区域鉴定等。RNA-Seq还可对可变剪接(Alterna tive splicing)进行定量研究。
• 2、转录本变异研究 在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码序列多态性 研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。
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• 3、非编码区域功能研究 转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。
ncRNA按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者 通常稳定表达,发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能, 主 要包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核 RN A(snRNA)及小核仁 RNA(snoRNA)等；后者主要包括长 链 ncRNA(lncRNA)和以microRNA为代表的小ncRNA(s mall ncRNA), 在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控 基因表达。
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转录组的含义：
• 转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下 转录出来的所有RNA的总和, 主要包括mRNA和非编码RN A(non-coding RNA, ncRNA)。
• 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解 读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。
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有关ncRNA的一些知识：
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三、RNA-seq技术优势
• 相对于传统的sanger测序法，RNA-seq具有以下优势： • 1、数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨
率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的 交叉反应和背景噪音问题。 • 2、高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 • 3、任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此 无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。 同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪 切位点及cSNP，UTR区域。