体细胞胚及人工种子
人工种子
人工胚乳一般由含有供应胚状 体养分的胶囊组成,养分包括矿 质元素、维生素、碳源以及激 素等。
三. 人工种子分类
根据Redenbaugh对人工种子的分类方法，可将人工种 子分为三大类： 裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。它们 在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不 能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的 发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞 胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再 经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能 力。
最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而 且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之 中。
人工种子还在继续研究中，目前还不
能大面积用于生产，因为还存在着难题： 体细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种 皮还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚待解决； 人工种子工厂化生产配套设施、及种子成 本过高等。这些问题一旦解决，人工种子 的应用将会展现广阔前景。
海藻酸钠易失水干缩，为克服此弱 点，采用二重结构，即在胶囊中包埋培 养液、保水剂，使体胚悬浮于培养基中， 为防止发芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。
三．人工种皮的装配
理想的人工种皮应该是： 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成 分不易流失，同时又具有良好的透气性。 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储 运性和适于机械化操作。 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 配制简单易行，成本低。
四. 人工种子的意义
其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高 效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种 性，又可以使之具有实生苗的复壮效应； 其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而 快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难 的植物更具有主要的适用意义；
第15章：人工种子1
因农业生产的季节性所限，需要人工种 子能贮藏一定时间。由于人工种子含水 量大，常温下易萌发，易失水干缩，贮 藏难度较大，所以人工种子的保存是目 前研究人工种子的另一个难题。目前报 道的方法有低温法、干燥法、抑制法、 液体石蜡法等，其中干燥法和低温法相 结合是目前报道最多的方法，也是目前 人工种子贮藏研究主要热点之一。
第15章 体细胞胚发生及人工种子制作
本章要点： 人工种子概念、结构、制作流程、优点和
缺点
所谓人工种子（artificial seeds） ，就是将组织培养产
生的体细胞胚或不定芽包裹在能 提供养分的胶囊里，再在胶囊外 包上一层具有保护功能和防止机 械损伤的外膜，造成一种类似于 种子的结构。
一、人工种子的概念
目前，世界范围内已进行人工种子试验的物种 有：胡萝卜、苜蓿、芹菜、黄连、刺五加、西 洋参、小麦、玉米、水稻、甘薯、橡胶树、柑 桔、云杉、大麦、油菜、桑树、檀香、百合、 莴苣、杨树等30多种植物。
三、人工种子的优点
天然种子是有性生殖的产物，在生产上 受季节限制，人工种子本质上属于无性繁 殖，因此具有以下优点： 1. 繁殖速度快。一个体积12L的发酵罐，20 几天生产的胡萝卜体细胞胚可制做1000万 粒人工种子，可供几十公顷土地种植之用。 2. 能够固定杂种优势，使F１代杂交种多代利 用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品 种，从而大大缩短育种年限，在一定程度 上取代了天然种子，起到节省种源的作用。
此外，ABA作为一种生长抑制剂，它能抑制次 级胚或不正常胚的产生并促进正常胚的发育和 成熟，对获得高质量的双子叶型正常体细胞胚 的发育十分有利。如在黄连体胚培养中，加入 0.5ppm的ABA，可使有效的体胚从56.4%增加 到81.3%。
人工种子的研究现状和发展前景
人工种子的研究现状和发展前景白雪11021295411级种工二班引言种子不仅是植物种续代繁衍之本，而且也是人类衣食之源。
春种一粒粟，秋收万颗籽。
”农业上传统的种植方式，大多是用种子播种来进行作物的繁殖与栽培。
植物人工种子的制作，是在植物组织培养基础上发展起来的一项生物技术。
“细胞工程技术的开展，为作物的育种与繁殖提供了不少新的技术手段。
在离体培养条件下，植物学家们已可使植物的一个芽、一小块茎、一小块叶甚至一个细胞再生成为小植株；在实验室里，一年四季可生产出成千上万的试管植物来。
植物人工种子作为一项新兴的生物技术，为农业生产展示了诱人的前景，已引起世界各国的重视。
尽管尚未进入应用阶段。
但目前植物人工种子技术发展迅速，在不久的将来定能发挥出其潜在的优势。
一．人工种子的概念植物人工种子（plant artificial seed）概念最早由Murashige （1978）提出，它是指利用细胞的全能性，将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够能够发育成完整植株的小颗粒。
天然的植物种子是由种皮、胚、胚乳三部分组成。
种皮是由珠被受精后发育而来，常具有多层细胞：外部为厚壁细胞，内部几层为薄壁细胞，排列紧密，有极强的保护作用机械力量。
胚乳由受精极核发育来，含有大量养料，为胚发育提供营养。
胚由受精卵（合子）发育而来，由胚芽、胚轴、胚根、子叶组成，将来发育成新的植株。
完整的人工种子包括：人工种皮、人工胚乳胚状体（体细胞胚）3 部分。
有的人工种皮是指海藻酸钠与氯化钙络合形成的包在胚状体等材料外的藻酸钙层，它具有一定的硬度，有保护功能。
有的人工种子在海藻酸钠胶囊外又包一层高分子化合物（Elvax4260 或聚丙烯酸酯），种皮就是指这层高分子化合物外膜。
人工种皮上没有种脐、种孔等结构。
人工胚乳常是人工配制的能供胚良好生长的培养基。
植物组织培养复习资料
植物组织培养复习资料一、名词解释。
（每个3分，共24分）１、植物组织培养：在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或发育成完整植株的技术。
又称植物离体培养。
２、细胞的全能性：指植物体的任何一个有完整细胞核的活细胞都具有该植物的全套遗传基因和产生完整植株的潜在能力。
3、脱分化：离体培养条件下生长的器官、组织、细胞，经过细胞分裂或不分裂而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞过程。
4、外植体：从活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。
5、单细胞培养：对分离的到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。
6、胚状体：亦称体细胞胚。
指在组培过程中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。
它具有根、茎结构，能够一次性形成再生植株。
7、平板培养：是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分配合，再倒入培养皿中进行培养的方法。
8、人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒状。
9、次生代谢产物：指植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。
10、再分化：细胞经过脱分化形成的愈伤组织再次分化，进行器官形成，产丛生芽或胚状体，形成完整植株的过程。
11、无病毒苗:指不含该种植物主要危害病毒的苗木。
二、不定项选择1、培养室里的湿度一般保持在____C_____.A 30~40%；B 50~60%；C 70~80%；D 80~90%2. 下列不属于生长素类的植物激素是____A D____。
A Kt；B IAA；C NAA；D ZT3. 影响培养基凝固程度因素有_______A B C D__.A 琼脂的质量好坏；B 高压灭菌的时间；C 高压灭菌的温度；D 培养基的PH4. 活性炭在组织培养中的作用有_______ABC_。
体细胞胚胎发生和人工种子
（二）、局限性
1、一些具有重要性状的植物目前发生体细胞胚的能力较弱， 再生系统尚不健全，难以形成有活力的胚并同步化发育。
2、制作的人工种子成本远高于自然种子，无竞争力。
3、人工种子的贮藏、运输以及机械化播种等问题尚未解决 。
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第29页，此课件共3凝胶中直接加入大量元素、碳水化合物及防病用抗生 素。
• 微型包裹法 将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然 后再把微型胶囊和种胚一起包裹在海藻酸钠中。
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2、植物组织培养的应用：
现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水 稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功，但由于成本 较高，中国尚未应用于生产。
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二、愈伤组织器官的发生
• 不定芽方式
• 胚状体形成的方式
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• 不定芽方式（adventitious bud type）是指
愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成 植株。这是愈伤组织中常见的器官发生方 式。
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• 愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生植株的方式主 要有四种：
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人工种皮需要满足的条件：
• 1、具有一定的透气性，不能影响胚状体的呼吸；
• 2、具有一定的硬度，经得起种子储存和运输中的挤 压和机械播种中的磨损；
• 3、易于降解；
• 4、含有其他有利于胚状体存活、生长的成分。
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B. 体细胞胚包裹的材料：
• 凝胶 • 可以使人工种皮具有柔软性，不仅适于胚
人工种子
主要内容
人工种子的概念及特点
概念 分类 特点 优点
人工种子的发展趋势 制造人工种子的关键技术
繁殖体的诱导 繁殖体的干燥与成熟 人工种子的包埋及人工种皮的装配
第一节 人工种子的概念与特点
一、人工种子(artificial seeds)的概念
人工种子（合成种子、体细胞种子）：
LH 100 谷氨酰胺 500 1 ADE 40 GA 0.3,IAA 0.3～0.5
21
21 21
油菜
桉树
茶树
华腺
萼木
MS，3% B5，4%～ 5% 改良H， 3% MS，4% MS,2%～ 3% MS，3% MS，0.2～ 0.3%
0.1 2～ 4 0.2～ 0.5 0.5～1 1
1
0.5 0.5
1 1 0.2 0.2
0.5 0.5 1 1
20 28～ 56 28 30 25 20
以胚状体为繁殖体的人工种子
物种
胡萝卜(Daucus carota) 芹菜（Apium raveolens）
主要结果
有菌土壤中发芽成苗 有菌条件下发芽成苗
物种
苜蓿（Medicago satioas） 柑橘（Citrussinensis× C.reticulata ） 甘薯（Ipomoea batatas） 玉米（Zea mays） 杂交水稻（Oryza sativa ×lifolia） 橡胶树（Hevea brasiliensis） 刺五加（Acanthopanax
1978年，Murashige提出可以用少量的外植体同步培养出众多
的胚状体，将这些胚状体包被在某种胶囊内使其具有种子的功能，则 可能直接用于田间播种 1985年，Kamada提出使用适当方法包埋组织培养所获得的具 有发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体和生长点等）
人工种子
3. 人工种子存在的问题及前景
1.体细胞胚的质量及大规模生产
3.金属离子 研究发现：Ca2+ 、Cu2+ 、Al3+ 可与海藻酸钠 Fe2 + 、Zn2+、Mn2+形成胶囊的外壳较软。 Ca2+ 可以作为很好的海藻酸钠的离子交换剂，用于人 工种子包被中，并对繁殖体的萌发与转化不造成 影响。
4.其他物质
（1）人工种子的优势之一是可以在胶囊中添加杀菌剂、 防腐剂、农药、抗生素、除草剂等，人为地影响和控 制植物的发育与抗逆性。 （2）如：在杂交稻体细胞胚人工种子中加入杀菌剂 （多菌灵和链霉素），发现其对人工种子在无菌条件 下的萌发和转化并无影响。说明杀菌剂可以在有菌条 件下应用于人工胚乳。
2.3 人工种子的储存
1.低温储藏技术 低温储藏是指在不伤害植物繁殖体的前提 下，通过降低温度来降低繁殖体的呼吸作用， 使之进入休眠状态。常用的温度一般是4℃。
在此温度下体细胞胚人工种子可以储存1~2 个月。非体细胞胚人工种子可以在$F下储藏更 的时间。
2.液体石蜡储藏技术 •液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质，常 被用来储藏细菌、真菌和植物愈伤组织。 •人工种子在液体石蜡中短时间保存（1个月）能 较正常的生长，但时间一长（79d），液体石蜡 对幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻碍作用。
•影响体细胞胚的诱导及植株再生的主要因素是外植 体的基因型、生理状况、用作外植体的植物器官以 及外植体与培养基的相互作用等。很多植物目前还 不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、 高质量的体细胞胚或不定芽。
《细胞工程》名词解释
植物细胞全能性:植物体的每个细胞都携带有该物种的全部遗传信息，因而只要在适当的条件下，植物一切生活细胞都具有分化为一个完整植株的潜在能力，这就是细胞的全能性。
这是细胞工程的理论基础。
细胞分化:个体细胞发育过程中，后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程。
脱分化:原已分化的细胞，失去原有的形态和机能，又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织，这个过程称为脱分化。
再分化:由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程，称为再分化愈伤组织:外植体在离体条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，称为愈伤组织。
愈伤组织细胞大而不规则,高度液泡化、没有次生细胞壁和胞间连丝。
继代培养:对来自于外植体所增殖的培养物通过更新新鲜培养基及不断切割或分离,进行连续多代的培养.外植体:植物组织培养中用来进行离体无菌培养的材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体。
器官发生:指离体培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官过程。
体细胞胚：由外植体可直接形成胚状体，外植体也可以经脱分化先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成胚状体。
胚状体是由体细胞发育而来人工种子：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚或珠芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒就称为人工种子。
繁殖系数：也叫增殖系（倍)数或增殖率，是指繁殖材料在一个培养周期内增殖的倍数。
污染：指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
褐变：指在组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。
玻璃化：指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。
悬浮培养：将游离的单细胞或小的细胞团，按照一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
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间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化， 并对其发育命运重决定而诱导出胚性细胞――诱导胚胎决定 细胞（IEDCs），进而形成体细胞胚。
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1 茎尖培 养诱导形 成胚性愈 伤组织
MS培养 基附加 2.0mg/L 2,4-D
2 胚性 愈伤组 织悬浮 培养增 殖
MS培养 基附加 2.0mg/ L 2,4-D
多 核明显，大，核仁
多
白色 粗糙 松散，水渍状 极少或无 管状或不规则形 稀薄，染色浅 少 核小，核仁少，或 无核
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相 比具有明显的特点：
1、具有两极性 2、存在生理隔离 3、重演受精卵形态发生的特性
二 、体细胞胚胎发生的方式
**植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳 为两类：直接途径和间接途径。 **直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发 育而成 **间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也 从已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰 （Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生 途径形成再生植株。
林木植物胞胚胎及人工种子
森环森保所 韩素英 2012.10
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体细胞胚及人工种子
第一节 体细胞胚的概念及其发生途径
体细胞胚胎发生的意义 体细胞胚胎发生的概念 体细胞胚胎发生的方式 体细胞胚胎的起源 体细胞向胚性转变的制机 体细胞胚胎发育成植株的能力 影响体细胞胚胎发生的因素 举例：落叶松体细胞胚胎发生
3 由细
4 体细
胞集合
胞胚萌
体形成
发并形
体细胞
成小植
胚
株
MS培养 基附加
2.0mg/ L 2,4-D
MS培 养基附 加
1.0mg /L ABA
图 甘薯品种栗子香胚性愈伤组-织诱导体细胞胚和再生小植株
胚性愈伤组织
非胚性愈伤组织
颜色 表面 质地 胚性细胞的多少 细胞形态 细胞质 内含物 细胞核及核仁
淡黄 光滑 坚硬但易碎 大量 小，圆球形 浓厚，染色深
澳大利亚林业部门已集中力量研究实施日益发展的商业化微繁技术； 泰国柚木改良中心，每年能培育出200万株生物苗;加拿大锡尔巴杰公
司研究使用不定胚生产云杉生物苗; 日本正在研究不定胚生产人工种子; 新西兰的辐射松纯林大都是利用生物苗营造的,现在塔斯曼林业公司每
年可产250-300万株生物苗,这是世界林业大有希望的领域。
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无论用常规方法，还是生 物技术，都应该向产业化方向 发展，对针叶树种来说，常规 方法很慢，体细胞胚胎发生则 可在短期内迅速扩大数量
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体细胞胚发生存在的问题
早萌问题 同步化的问题 体细胞胚不生根 下胚轴不伸长 子叶发育不正常
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一、体细胞胚的概念
体细胞胚（somatic embryo）又 称胚状体，是指离体培养条件下没 有经过受精过程而形成的胚胎类似 物。
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美国的Weyerhaeuser公司用1升的三角瓶液体培养黄杉、火炬松、挪威 云杉的ESM （embryo-genic suspensor mass）培养物，用这套系统生产 了1千多棵黄杉再生植株和4千多棵挪威云杉的再生植株；
美国WESTVACO公司的火炬松、新西兰的辐射松、加拿大CELL FOR FORESTRY公司的云杉、冷杉、花旗松等都致力于通过体细胞胚胎发 生途径进入规模化生产；
林业上，体细胞胚胎发生是限制林业产业化和 无性系化的关键技术，更是世界林业优良针叶 树新品种实现快速繁殖的重要手段。
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在应用上，体细胞胚胎发生是进行遗 传转化、种质保存、快速繁殖 、生理生 化基础研究等的重要手段 ；
它也是基因工程的桥梁，在林木的大 量繁殖、品种改良、林木更新、沙漠改造 等方面都有很大现实意义和经济效益。尤 其对于针叶树难以无性繁殖的树。
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1 直接途径
直接发生体胚的来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、 幼胚、悬浮培养的细胞和原生质体。 一般认为直接方式发生体胚是由原先就存在于外植体中的胚 性细胞――预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发 生而形成体胚，如柑桔属的珠心组织（在体内或离体情况） 通过预胚胎决定细胞直接进行体胚发生的最好例子.
体细胞胚胎发生的意义
“How does a Single Somatic Cell Become A Whole Plant” (如何使一个单细胞发育成一 棵完整植株，是世界科学必须解决的问题)
是2005年SCIENCE杂志上提出的世界科学界 25大问题之一(One of 25 “What don’t we know” in SCIENCE Vol 309,1 July 2005)
体细胞胚的发生
单细胞悬浮培养 原生质体培养 组织器官培养
花粉培养 合子胚
无融合生殖胚
体
细 胞 胚
非 非合 合子
子细
花
胚胞
粉
胚
**大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮 培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚
胎发生或花粉胚胎发生（pollen embryogenesis） **前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构 **后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的 体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos），可发育成 单倍体植株。
体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一 个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的 胚状结构，包括以下几点含义： 1、体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生 殖的胚，只限于在组织培养范围使用； 2、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；
3、体细胞胚的形成经历胚胎发育过程，区别于组
织培养的器官发生中芽与根的分化。
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自1985年，第一例针叶树体细胞胚发生以来， 国内外通过体胚发生获得完整植株有一些报道和专 利，取得很大进展；Hakman首次报道挪威云杉未 成熟胚形成体细胞胚并再生植株以来，国内外已从 30多种不同针叶树培养产生了体细胞胚（Tautorus, 1991），，迄今为止，已经有加勒比松(Jain S.M., 1989)、糖松(Gupta P.K. ， Durzan D.J., 1986)、火 炬松、（Becwar M.R.,1989） 落叶松