STED显微镜
超分辨显微镜的工作原理和应用
超分辨显微镜的工作原理和应用随着科技的飞速发展，人们对于微小的物体的研究越来越深入。
在过去，显微镜可以提供的最高分辨率为200nm左右，然而很多细胞和物质需要更高的分辨率才能被准确的研究。
超分辨显微镜(deconvolution microscopy)因而被应运而生，它的分辨率可以达到20nm以下，是传统显微镜的10倍以上。
下面，本文将为你介绍超分辨显微镜的工作原理和应用。
一、超分辨显微镜的工作原理超分辨显微镜的工作原理是使样品产生的荧光分子处于暗区域退回到明亮区域，通过这种方法，显微镜能够获取比传统显微镜更清晰的图像。
在超分辨显微镜之前，由于空气折射率的限制，显微镜无法将细胞成像到更高的分辨率。
超分辨显微镜通过不同的方法打破了这个技术障碍。
例如，受到今天最先进的高清电视和摄像机技术的启发，超分辨显微镜使用一种称为激发的荧光分子反转的技术（Stimulated Emission Depletion，简称STED）来实现高分辨率显微成像。
基本上，STED方法是通过在激光束之间使用减少荧光过程的抵消光束来使荧光分子处于暗区域"退回"到明亮区域的。
荧光物质只能在光束中的明亮区域发光，当光束聚焦到小于荧光分子的空间大小时，荧光分子会产生干扰，使得分辨率变得模糊。
为了解决这个问题，STED技术增加了所有光束之间的强烈相互作用，目的是将荧光分子拉回到它们本应该出现的明亮区域。
这使得STED显微镜能够放大高达20nm以下的样品。
二、超分辨显微镜的应用超分辨显微镜的应用涵盖了许多生命科学领域，从细胞核到分子水平都有广泛的应用。
（一）细胞功能研究超分辨显微镜的分辨率可以揭示小分子的扩散、细胞器动力学和蛋白质亚细胞位置，在细胞功能研究中有着重要的应用。
例如，在分子分布的研究中，超分辨显微镜可以帮助研究人员观察受体和离子频繁转位的过程。
该技术还可以用于研究神经元的突触功能，因为它可以检测小型生物分子如神经递质的扩散情况。
213456825_浅析高数值孔径对STED_超分辨显微成像的影响
0 前言STED超分辨率显微镜已被广泛应用于大气水体环境物质检测、生理病理检测以及生物制剂研制与生产等领域，具有分辨率高、聚焦能力强等优点[1]。
对传统的显微成像效果影响因素的研究较为成熟，对STED超分辨率显微成像影响因素的研究还有较大的提升空间[2]。
当前，很多使用者片面认为数值孔径越大，STED超分辨率显微镜的成像效果一定就越好[3]，未进行更深入的定量定性分析。
实际情况并非完全如此，因此，研究高数值孔径对STED超分辨率显微成像的影响具有重要的理论和现实意义。
该文按照从理论到实际的思路，分别对STED超分辨率显微镜的原理、作用以及不同评价指标等进行阐述，从有利影响、不利影响2个方面论述了高数值孔径对STED超分辨率显微成像的影响，并提出了一种新颖的定量确定高数值孔径的算法。
1 STED超分辨率显微成像受激辐射损耗（STED）对设备要求相对较高，可以实时拍摄且成像速度快，医学实践中常用于活细胞成像追踪与检测。
1.1 STED超分辨率显微成像的原理和作用STED显微技术作为第一个突破光学衍射极限的远场显微成像技术，其基本原理是采用2束激光同时照射样品，其中一束激光用来激发荧光分子，使物镜焦点艾里斑范围内的荧光分子处于激发态；同时，用另外一束中心光强为0 cd 的环形损耗激光与其叠加，使物镜焦点艾里斑边沿区域处于激发态的荧光分子通过受激辐射损耗过程返回基态而不自发辐射荧光，因此只有中心区域的荧光分子可以自发辐射荧光，从而获得超衍射极限的荧光发光点。
1.2 STED超分辨率显微成像的评价指标STED超分辨率显微成像技术有多项评价指标，一般是针对物镜的。
1.2.1 分辨率显微镜的分辨率是最核心的指标，它是指能够清晰区分2个物点的最小间距，在有些场合又被称为鉴别率。
物镜的分辨率与光线波长成正比，与数值孔径成反比。
由于在现实中选择不同波长光线的可能性不大，因此数值孔径成为影响分辨率的唯一因素。
1.2.2 焦深焦深就是焦点深度，是指当用物镜进行对焦时，在焦点上、下延伸一定范围，在这个范围内也是完全意义上的清晰区域，这个延伸范围的高度就是焦深。
STED超分辨成像技术
STED超分辨成像技术超分辨光学成像超分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限（200nm）的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。
简介光学显微镜凭借其⾮接触、⽆损伤等优点，长期以来是⽣物医学研究的重要⼯具。
但是，⾃1873年以来，⼈们⼀直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm，⽆法⽤于清晰观察尺⼨在200 nm以内的⽣物结构。
超分辨光学成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世纪光学显微成像领域最重⼤的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限（换⾔之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像），为⽣命科学研究提供了前所未有的⼯具。
光学显微镜的分辨率1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值约为l / 2NA（分辨率极限公式），其中l是光波波长，NA是光学系统的数值孔径（Numerical Aperture）。
, n为介质的折射率，a为物镜孔径⾓的⼀半。
成像时若使⽤波长为400 nm的光，并采⽤空⽓（折射率为1）作为物镜和样本之间的介质，可计算得到分辨率极限为200 nm。
因此，我们通常说，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm。
此后的研究表明，光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（称为艾⾥斑, Airy disc）的尺⼨。
另外，当⼀个艾⾥斑的边缘与另⼀个艾⾥斑的中⼼正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被⼈眼或光学仪器所分辨（这个判据称为瑞利判据，Rayleigh Criterion）。
利⽤瑞利判据以及艾⾥斑的数学表达式，我们可以得到光学显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。
值得指出的是，光学显微镜的分辨率公式跟前⾯提到的分辨率极限公式有所不同，⽽前者更⼴泛的被光学成像领域使⽤。
超高分辨率显微成像技术研究进展
超高分辨率显微成像技术研究进展近年来，随着科技的不断进步和人类对生物学的深入研究，超高分辨率显微成像技术越来越受到科学家们的关注。
这项技术可以对生物体的微观结构进行拍摄，可以帮助科学家更深入地了解生物的细节，从而推动科学研究的进步。
一、超高分辨率显微成像技术的背景随着显微镜技术的发展，传统的显微镜已经无法满足科学家们对细胞结构和功能的研究需求。
传统的显微镜分辨率受到了衍射极限限制，而且不能同时获得三维立体结构信息。
为了解决这个问题，科学家们开发出了一系列超高分辨率显微成像技术。
二、超高分辨率显微成像技术的研究进展1. STED显微镜技术STED（Stimulated Emission Depletion）显微镜技术是一种超高分辨率显微成像技术，它可以将分辨率提高到几十纳米以下。
STED显微镜利用一个特殊的激光光束来激发标记分子，随后又用另一个激光光束来抑制这些分子的荧光发射，从而实现超高分辨率成像。
2. PALM/STORM技术PALM（Photoactivated Localization Microscopy）和STORM （Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）技术是另外一种超高分辨率显微成像技术。
它们利用光敏分子，在显微镜下进行光触发，并记录光敏分子的位置。
通过将这些位置信息合并，可以获得高分辨率的成像结果。
3. Structured Illumination Microscopy技术结构光显微镜是另一种常见的超高分辨率显微成像技术。
它通过使用特殊的光学镜头和计算机算法，使得分辨率能够提高到几十纳米以下。
此项技术已广泛应用于细胞和生物分子的成像研究。
三、超高分辨率显微成像技术的应用超高分辨率显微成像技术可以应用于多个领域，包括生物和医学研究。
它们可以用来研究肿瘤细胞、人类细胞中的蛋白质分布和代谢物转运等。
此外，该技术还可用于实现微型器件或纳米机器的自组装、拓扑结构研究、甚至与量子技术的研究有所关联。
徕卡显微镜惠更斯STED反卷积快速指南
徕卡显微镜惠更斯STED反卷积快速指南本文档的目的是给徕卡STED用户简要介绍了使用与Leica TCS STED SP8 3倍显微镜获得的图像惠更斯专业解卷积图像。
图1（从左至右）：共焦; 受激发射损耗; 受激发射损耗反褶积参数编辑器（在图像的缩略图右键点击）图2：概述惠更斯图像参数编辑器。
这个窗口可以访问所需的受激发射损耗解卷积图像的所有相关图像参数。
导入时，LIF文件，大部分参数都自动从元数据提取（见惠更斯Pro用户指南从SVI更多信息）。
采样间隔（XYZT）：从图片属性获得的值显微镜类型：值从图片属性取数值孔径：数值从图片属性取客观质量：取默认值“好”盖玻片位置：使用专用工具（图示左侧）拍摄方向：对于DMI显微镜总是“向上”针孔间距：不相干的共焦/ STED显微镜镜片浸泡：用“油”包埋剂：从下拉菜单中选择合适的媒介。
Backproj。
从图片属性获得的值：针孔激发波长值从图片属性取发光波长值从图片属性取多光子激发：值从图片属性取激发填充因子：从图片属性获得的值; 默认值= 2，除了TiSaph受激发射损耗（值= 1.2）受激发射损耗耗尽型：从图片属性获得的值STED饱和系数：见下面的更多细节受激发射损耗波长值从图片属性取受激发射损耗免疫力分数：见下面的更多细节受激发射损耗3X：请参阅下面的详细资料受激发射损耗饱和度的因素饱和因素原本是指期限：这是受激发射损耗分辨率公式的一部分：它定义了STED PSF的全宽半高（FWHM），最后STED图像的分辨率。
与门控受激发射损耗和TCS STED SP8 3X，经典的理解饱和因子（主要依赖于激光强度和所选择的染料的消耗效率）的实施是由包括关于激励和损耗激光模式（附加信息扩展脉冲或CW）和门控检测。
在实践中，有两个参数影响STED的分辨率，因此惠更斯饱和系数：STED耗尽激光强度和栅极起始数值。
请记住，为了简化和整体实用性，被用于受激发射损耗PSF在惠更斯的计算只有一个“理想”染料的I SAT值。
高分辨率成像技术在生物学研究中的应用
高分辨率成像技术在生物学研究中的应用随着生物学的快速发展和突破，高分辨率成像技术在生物学研究中扮演着越来越重要的角色。
传统生物学技术只能观察到简单的细胞结构，而高分辨率成像技术能够将生物体内的微观结构准确、精细地呈现出来，为科学家们提供了强有力的工具来研究生物体内的各种过程和机制。
1、STED显微镜像素与像素之间的距离可以小于物体大小，从而使得成像能够非常精确。
地面重建图像甚至能够达到XX±XX nm的分辨率，这种系统可用于广泛的生物领域。
它是目前分辨率最高的成像系统之一。
STED显微镜通过施予样品一个光的环（脉冲激光束）并在数字控制时期迅速改变它的形状来实现高分辨率成像，具有高空间解析度和高对比度。
2、单分子显微镜单分子显微镜是目前生物学界最常用的高分辨率成像技术之一，它主要用于研究生物分子的动态变化和移动过程。
与传统显微镜相比，它可以看到单个分子的运动和互动，这使得研究人员不仅可以观察整体分子群体的平均性质，还可以研究分子在空间和时间上的变化。
单分子显微镜主要由荧光基质和荧光\蛋白标记技术制成。
在观察样品时，单分子显微镜使用荧光素（如Cy5和AlexaFluo）的合适发射和激发波长调节荧光标记的分子，使这些分子可以发出有区别的荧光信号，并且可以检测到单个分子的位置。
通过这种方法，可以在细胞表面看到细胞表面分子的分布，以及观察单个分子的运动和交互。
3、电子显微镜随着高分辨率成像技术的不断发展，电子显微镜已经成为生物领域中一个日益重要的工具。
相对于传统的光学显微镜，电子显微镜可以提供更高分辨率、更高对比度和更清晰的图像。
因为它使用的是如电子束之类的高能束，比光束分辨率更高。
电子显微镜主要用于观察生物细胞、组织、细胞器和分子，广泛应用于生物学、药物学、植物学等领域。
例如，在药物研究中，电子显微镜可以直接观察到药物的活性，并探索该药物与蛋白质结合的生化机制。
4、光片制备技术光片制备技术是一种能够为生物样本提供高分辨率成像的新型技术，它可以通过移除不需要的标记或缓冲液，并将样品固定在光学晶片上，使得样品蒸发和干燥时不会发生形态变化。
STED纳米显微术
超连续激光源为STED显微技术的普及开辟道路作者：Fianium公司来源：激光世界远场荧光显微技术普遍应用于生命科学研究领域。
标准的远场荧光显微技术的分辨率受衍射极限公式d=/(2NA)所限制。
其中，λ是入射光的波长，NA为物镜的数值孔径。
受激发射损耗（STED）显微技术克服了衍射极限问题，该技术利用钛宝石和固体半导体激光组合，将图像分辨率提升到了大分子水平。
这项崭新的远场荧光纳米显微技术，已经应用于很多前沿科学研究中，特别是生命科学领域。
在标准实验条件下，一组强度足以激化荧光体的脉冲激光，通过物镜聚焦到衍射极限的光影，与另一组STED光束重叠。
STED光束的中心为零能量，周围是很陡的能量边沿，其横截面的形状像中空的甜香饼。
STED光束与激化光束同步或相差数皮秒到达同一焦平面；激化光束迅速“熄灭”被STED 激化的分子；随后，把STED光束波长微调到荧光体光谱的红光边沿，同时将脉冲频宽调整在荧光体发光时段内，即1～5ns，效果最为理想。
荧光染色分子发射的机率随着STED的脉冲能量而降低；基于此现象，染色分子发射荧光的能力将受次衍射中心光环范围的约束，规范了显微镜的有效“点扩散函数”（Point Spread Function，PSF）。
观察样品衍射极限以外的范围，可以通过激光扫描显示样品的全貌。
如果能量强度Is可以把50%荧光体强度降低，它的半高全宽（FWHM）在焦平面的有效“点扩散函数”PSF大约为r ≈ λ/(2NA1+I/Is)，典型的有机染剂强度Is值大约为10～30MW/cm2。
松散的三重态（Triplet-state Relaxation，简称T-Rex）或松散的黑暗态（Dark-state Relaxation，简称D-Rex）STED显微技术是高效的改良型STED显微技术，也是目前为止能提供最高分辨率的显微技术。
其原理是降低或消除光漂白现象，其中重点是避免产生三重态。
实际上，就是确保两个连续脉冲波的时段大于荧光体所激化的超稳定黑暗态的平均存在时间。
STORM和STED显微成像技术特点的比较
STORM和STED显微成像技术特点的比较宗艾伦;周迎生【摘要】随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术和受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微镜技术是近年来发展迅速的两种超分辨率荧光显微镜技术.这两种技术均提供超越传统荧光显微镜分辨率成像的功能,具有多色显像,三维成像以及活细胞内成像的潜力.在这篇综述中,我们关注两种技术荧光控制、激光强度等技术参数设定,同时结合样品制备、图像采集与处理等流程优化对比两者在分辨率、图像采集时间及具体应用中的优劣.STORM可获得更高的三维分辨率,但可能需要更长的图像采集时间.STED需要较高损耗光强度,却能在图像采集后立即生成超分辨率图像,不需要额外图像数据处理.最终,选择STORM和STED不仅取决于技术的具体应用,还取决于操作者优化各环节技术参数的能力,从而决定图像质量.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2019(027)001【总页数】4页(P115-118)【关键词】超分辨率荧光显微镜技术;随机光学重建显微镜;受激发射损耗显微镜【作者】宗艾伦;周迎生【作者单位】首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科,北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029;首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科,北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029【正文语种】中文【中图分类】Q95-33光学显微镜和电子显微镜，是研究亚细胞结构最常用的两大类显微镜技术。
光学显微镜可根据光源不同分为普通光、荧光、红外光显微镜等。
荧光光学显微镜以免疫荧光染色为技术基础，以荧光抗体为成像探针只选择与荧光抗体特异结合的结构进行成像。
光学显微镜分辨率定义为显微镜下可分辨两独立同亮度理想点光源间的最小距离。
因存在衍射，成像为光斑而非理想光点。
当两光点过于靠近，其像斑重叠时，无法将两点区分开，即光学系统中存在一分辨率极限。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4pi显术简介
4pi也是HELL发明的.而样品的成像通过两个物镜的 亚衍射尺寸的光斑来扫描样品实现的.
缺点 1.需要强光,能量利用率低. 2.过强的光还会引起光致漂白. 3.略贵 4.应用范围较窄 受激损耗的原理也可以应用在其它地方,比如近年来 在纳米光刻领域引起重点关注的双光束刻录技术.
受激发射损耗的基本原理
如果你有一根粗笔，怎么能够用它画细线？ 买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分. STED用的就是这个原理。 使用一种合适的激光,仅激发一个点的荧光基团使其 发光,然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围 的荧光强度,这样就只有一个点发光并被观察 了.
受激发射损耗的基本原理
损耗光的波长要选在荧光发射谱的红边,以避免重激 发,激发光与损耗光的时间差要选的合适,既保证有 荧光产生,又能保证一定的损耗几率.
STED荧光显微镜示意图
环形的损耗光是利用一个位相片进行光位相调制， 最终在焦点处形成环形光分布。 按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等荧光物质跃迁上 去了,马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左 右），用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测 过来的自发辐射信号,移动样本就可以三维成像. 起初的主要用于突破STEM显微镜主要用于突破横 向衍射极限 ,横向分辨率可达70nm,而轴向分辨率还 较低, 因为有限的孔径角导致轴向分辨率降低. 近来将和4pi显微术互补性地结合 ,在技术上扩大了 有效孔径角.目前已经获得了100nm的轴向分辨率.
某种染料的光谱.图中蓝色曲线为激发光谱,红色曲线为发射光 谱.620nm~850nm均有可能,670nm最大.这是自发辐射.
STED的发明
STED 受激发射损耗显微术是在 1994 年被施特芬-赫 尔开发出来的,当时赫尔正躺在研究生公寓的床上看 一本有关光学量子理论的书,突然灵光一闪,就发明 了STED. Stefan W. Hell（生于1962年)物理学博士学位，1990 年开始在海德堡大学学习，后留在海德堡欧洲分子 生物学实验室研究.1993年到1996年，他曾作为高级 研究员，在芬兰土尔库大学开发受激发射损耗显微 镜 .1996年，他在哥廷根的马克斯普朗克生物物理 化学研究所，在那里他建立了他目前的研究小组， 致力于高分辨率显微镜的研究。
衍射极限
突破光学衍射极限的办法之一是近场光学显微镜,它 是利用探针探测样品表面的隐失场而获得样品表面 信息. 在一些领域,比如生物上观察活细胞,仅有表面信息 是远远不够的,迄今为止远场光学显微术仍是显示细 胞内部三维结构的重要方法. STED荧光显微镜是一种可以突破光学衍射极限的远 场光学显微术.
激发光可以使基态荧光粒子从基态跃迁到激发态,随 后用损耗光(损耗光就是用来损耗荧光的光)照射样 品,引起荧光物质的受激辐射, 消耗了可以发射荧光 的能级(荧光态)上的粒子数。受激辐射的作用是迫 使粒子在它们被激发之后立刻回到基态 ,使焦斑上 那些受到损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力 , 而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域 内, 于是获得了一个小于衍射极限的发光点. 激发光将基态粒子激发到激发态后,向下跃迁的几率 K=σ×I.
其中σ是分子的吸收截面,I是损耗光的光强. 损耗光的光强越大,损耗的荧光分子越多
通过损耗后 ,外围的荧光被强烈地损耗而留下中心 的荧光 ,但是边缘仍会有残留荧光,可以通过改变入 射光波的波前分布来模糊边缘的荧光.
荧光的产生是自发辐射,处于激发态被损耗光照射后 是受激辐射,受激辐射发出的光子与吸收的光子相同, 选择合适的波长的损耗光就可以使激发态的染料发 出特定波长的光(激光的原理).
荧光物质
有机荧光物质是一类具有特殊光学性能的化合物, 它们能吸收特定频率的光, 并发射出低频率(较长波 长) 的荧光来释放所吸收的能量。某些有机化合物 在紫外和短波长的可见光的激发(这种用来激发的 光叫激发光)下能发出荧光, 产生可见光谱中鲜艳的 颜色, 这类物质称为日光型荧光染、颜料。
荧光物质分子一般都含有发射荧光的基团(称为荧 光团) 以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助 色团
衍射极限
18 世纪 70 年代,德国物理学家恩斯特-阿贝(Ernst Abbe)发现,可见光由于其波动特性会发生衍射,因而 光束不能无限聚焦.后经瑞利归纳为瑞利判据. 以前人们认为传统光学显微镜的极限为200nm(λ/2). 小于这个尺寸的物体必须借助电子显微镜或隧道扫 描显微镜才能观察。