二苯胺显色法测定DNA含量-生物化学与分子生物学
二苯胺显色法测定DNA含量
离心机的使用
打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧；
离心过程中不要用重物撞击离心机；
兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原 理和方法 掌握离心机的使用方法
实验原理
在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白的溶解度最低。 用0.15M氯化钠溶液洗涤可洗去其它物质。 沉淀用SDS处理，SDS使蛋白质与DNA解离，再用氯仿 －异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。 DNA溶液用乙醇沉淀析出。
加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。
SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。
加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白
相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要
吸到蛋白相。
CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出
逐滴加入0.5ml 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min
去塞！离心
挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解
加1ml 5M NaCl
吸取上清液 勿吸到中间层！
要等离心机完全停止转动后再打开盖子。
二苯胺显色法测定DNA含量
DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告
DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告实验目的：本实验旨在掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。
实验原理：在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。
其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω-羟基-y-酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。
当样品DNA的含量在40-400µg范围时，光密度与DNA的浓度成正比。
样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质、脱氧核糖、阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。
在反应中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
试剂与仪器：DNA标准液、二苯胺试剂、样品溶液、试管与试管架、吸管与洗耳球、可见分光光度计。
DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定：取8支洁净干燥的试管，按表格操作。
混合后，于60度水浴中保温1小时，冷却至室温中，用分光光度计测定吸光值A595nm。
以DNA浓度为横坐标吸光值A595nm为纵坐标，绘制标准曲线，对照组标准曲线计算样品中DNA的含量。
实验结果与讨论：通过实验得出DNA标准曲线，y=0.0098x，求出X1=40.71µg/ml，X2=39.39µg/ml，平均DNA 浓度为40.05µg/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%。
注意：文章中的一些数字和符号可能需要根据实际情况进行调整。
分析：本实验使用标准曲线求得的DNA浓度为40.05µg/ml。
在40-400µg范围内，光密度与DNA浓度成正比，因此使用标准曲线求得的浓度是准确的。
此外，DNA的标准曲线线性关系的R2为0.9966，证明DNA光密度的关系密切，因此求出的浓度也比较精确。
然而，本实验测得的DNA含量比整体水平偏低。
造成这种偏低的原因可能是以下几个方面：1.在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，从而导致实验存在误差。
DNA的定量测定
六、思考题
1、 DNA含量测定的方法有哪些？ 各有何优缺点？ 2、简述二苯胺法测DNA的基本原 理。
分光光度计
开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波 长调至测试用波长。仪器预热20分钟。 预热后，打开试样室盖（光门自动关闭），调 节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上试样 室盖，将盛有参比溶液的比色皿架置与校正位 置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮， 使数字显示为“100.0”。连续几次调整“0”和 “100%”，仪器即可进行测定工作。 将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮， 使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入 光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
样品的测定
取待测样品2mL，加入二苯胺溶液4mL，摇匀，沸水 中反应10分钟，冷却，然后在595nm波长出测定光 密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得 相应的DNA的ug数，按下式计算每100g兔肝组织中 的DNA的含量。
待测样品中测得的DNA的µg数 的 数 待测样品中测得的
DNA含量 DNA含量＝ 含量
试管
标准DNA/mL 标准 蒸馏水/mL 蒸馏水 二苯胺试剂 /mL
1 0 2 4
2 0.2 1.8 4
3 0.4 1.6 4
4 0.6 1.4 4
5 0.8 1.2 4
6 1.0 1.0 4
沸水中反应10分钟，冷却， 595nm波长处比色 沸水中反应 分钟，冷却，在595nm波长处比色 分钟 光密度值
图5 仪器外形图 1．数字显示器 2．吸光度调零旋钮 3．选择开关 4．吸光度调斜率电位器 5．浓度 ． ． ． ． ． 旋钮 6．光源室 7．电源开关 8．波长手轮 9．波长刻度窗 10．试样架拉手 ． ． ． ． ． 11．100%T旋钮 12．0%T旋钮 13．灵敏度调节旋钮 14．干燥器 ． 旋钮 ． 旋钮 ． ．
DNA的定量测定
实验八DNA的定量测定一、实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的方法。
二、原理核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA 的颜色反应方法。
本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。
在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40～400μg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。
DNA +三、试剂和器材1. 试剂200μg/mL DNA标准溶液、二苯胺试剂2. 器材可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平四、操作步骤1. 标准曲线的制作取12只试管分成6组，按下表操作。
取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
试管0 1 2 3 4 5标准DNA/mL 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水/mL 2 1.6 1.2 0.8 0.4 04 4 4 4 4 4二苯胺试剂/mL60℃恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色2. 样品的测定取待测样品2mL，加入二苯胺溶液4mL，摇匀，60℃保温1h，然后在595nm波长出测定光密度值。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA 的ug数，按下式计算待测样品的DNA的含量。
DNA%＝待测样品中测得的DNA的mg数 X 100待测样品液中样品的mg数五、注意事项其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽可能除去。
六、思考题1、DNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？2、简述二苯胺法测DNA的基本原理。
DNA 的定量测定
实验六DNA 的定量测定（二苯胺法）一实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA(脱氧戊糖基）H+HO CH2C CH2CH2蓝色化合物DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。
当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。
三试剂和器材（一）器材1．粗制DNA。
2．坐标纸。
3．试管1.5 cm *15 cm （*7）4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。
5．722 型（或7220 型）分光光度计。
6．恒温水浴锅。
（一）试剂1．DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。
2．二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。
当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。
3．DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控制其DNA含量在100μg/ml左右。
四操作方法1．标准曲线的绘制按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃恒温水浴保温45 min，冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。
2．样品的测定吸取DNA样液1.0 ml，加入蒸馏水1.0 ml，混匀。
生物化学第五章核酸化学习题含答案
核酸的化学一、是非题1．嘌呤碱分子中含有嘧啶碱结构。
2．核苷由碱基和核糖以β型的C—N糖苷键相连。
3．核苷酸是由核苷与磷酸脱水缩合而成，所以说核苷酸是核苷的磷酸酯。
4．核苷酸的碱基和糖相连的糖苷键是C—O型。
5．核糖与脱氧核糖的差别是糖环的2’位有无羟基。
6．核苷酸的等电点的大小取决于核糖上的羟基与磷酸基的解离。
7．在DNA双链之间，碱基配对A-T形成两对氢键，C-G形成三对氢键，若胸腺嘧啶C－2位的羰基上的氧原于质子化形成OH，A－T之间也可形成三对氢键。
8．任何一条DNA片段中，碱基的含量都是A=T，C=G。
9．DNA碱基摩尔比规律仅适令于双链而不适合于单链。
10．用二苯胺法测定DNA含量必须用同源的DNA作标准样品。
11．DNA变性后就由双螺旋结构变成线团结构。
12．Tin值低的DNA分子中（A－T）％高。
13．Tin值高的DNA分子中（C-G）％高。
14．由于RNA不是双链，因此所有的RNA分子中都没有双螺旋结构。
15．起始浓度高、含重复序列多的DNA片段复性速度快。
16．DNA的复制和转录部必须根据碱基配对的原则。
17．某氨基酸tRNA反密码子为GUC，在mRNA上相对应的密码子应该是CAG。
18．细胞内DNA的核苷酸顺序都不是随机的而是由遗传性决定的。
19．RNA链的5 ′核苷酸的3′羟基与相邻核昔酸的5′羟基以磷酸二酯键相连。
20．假如某DNA样品当温度升高到一定程度时，OD260提高30％，说明它是一条双链DNA。
21．核酸外切酶能够降解所有的病毒DNA。
二、填空题1．核苷酸是由＿＿＿、＿＿＿＿和磷酸基连接而成。
2．在各种RNA中＿＿含稀有碱基最多。
3．T m值高的DNA分子中＿＿＿的％含量高。
T m值低的DNA 分子中＿＿＿％含量高。
4．真核生物的DNA存在于＿＿＿＿，其生物学作用是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
5．细胞内所有的RNA的核苷酸顺序都是由它们的＿＿＿＿＿＿决定的。
6．将双链DNA放置在pH2以下或pH12以上，其OD260＿＿＿，在同样条件下单链DNA的OD260＿＿＿＿＿＿。
生物化学实验课讲义
实验一二苯胺法测定DNA含量【实验目的】1．掌握721型分光光度计的工作原理及操作方法。
2．掌握二苯胺法测DNA含量的原理和方法。
【实验原理】DNA酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤、磷酸和脱氧核糖。
脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
样品中DNA浓度50～500μg/mL范围内，光密度与DNA的浓度成正比，可用比色法测定。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)试管、吸量管、容量瓶、试管架(2)721分光光度计(3)恒温水浴锅(4)分析天平2．试剂(1)DNA标准溶液：取DNA钠盐(经定磷确定其纯度)用5mmol/LNaOH配成200µg／mL的溶液。
(2)二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）1g溶于100mL冰醋酸(A．R)中，再加入10mL过氯酸(A．R，60％以上)，混匀待用。
临用前加入1mL1.6％乙醛溶液，所配得试剂应为无色，贮于棕色瓶中。
(3)1.6％乙醛：取47％乙醛3．4mL，加重蒸水定容至100mL(保存于冰箱中，一周内使用)。
(4)DNA样液：将DNA干燥粗制品以5mmol/LNaOH溶液配制成100µg／mL的溶液。
【实验操作】1．标准曲线的制作：取14支试管，分为2组（管号为：0～6，0´～6´）按下表操作。
以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品的测定：取2支试管（7号和7´号）各加入2mL样品液(内含DNA应在标准曲线的可测范围之内)，按下表操作。
表1DNA含量的测定【计算】根据测得的光密度值，从标准曲线上查DNA的含量，按下式计算制品中DNA的百分含量：实验二酵母RNA的提取与鉴定【实验目的】掌握RNA的提取及鉴定核酸组分的方法【实验原理】酵母中RNA含量较高。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
二苯胺的使用
⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。
⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。
鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
⼆苯胺试剂的配制A液： 15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。
B液： ⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。
DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。
2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。
在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。
沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。
⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。
⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。
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加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。 SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA 溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。
CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。
离心机的使用
打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧；
离心过程中不要用重物撞击离心机；
加约2倍 体积 95% 乙醇
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出
逐滴加入0.5ml 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min
去塞！离心
挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解
加1ml 5M NaCl
（4）评价所建立的树，分析其生物学意义
第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的
学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机及岛津UV-120的使用方法
实验原理
利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在 0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在 0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核 糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉
系统发生树性质：
末端分支 理论上，一个DNA序列在物种形成或基因复制 时，分裂成两个子序列，因此系统发育树一般
末端物种
中间枝条 节点 根
是二歧的；
如果是一棵有根树，则树根代表在进化历史上 是最早的、并且与其它所有分类单元都有联系 的分类单元，反映时间顺序； 如果找不到可以作为树根的单元，则系统发生
综合性设计性实验-5
生物基因组序列比对分析，分子进化
兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定DNA含量
目的基因SNP位点的鉴定及其意义
此实验共包括如下三个部分
1. 2. 3. 第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化 第二部分：兔肝DNA的提取和测定 第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义
吸取上清液 勿吸到中间层！
注意事项
尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。
搅动不要太大，以免使DNA断裂。
整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。
淀除去，而DNA则溶解。
实验操作
1. 弃上清留沉淀
兔肝
离心
1X SSC洗 两次
加至8ml 1X SSC
3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白）
称取4 g 加 8ml 1X SSC
离心
匀浆、过滤
2.弃上清留沉淀
取8ml匀浆液 离心
加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA
沉淀
等体积氯仿-异 丙醇混合液
比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的 cDNA克隆以及基因组
克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情 况，提示染色体或染色体片段上的同线性（synteny）或共线性（collinearity），从 而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究， 不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化
树是无根树，反映距离；
从根节点出发到任何一个节点的路径指明进化 时间或者进化距离。
基因分子进化分析步骤
（1）以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列
（2）将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，Clustal X
（3）构建系统发生树：MEGA，PHYLIP，PAUP
/
第一部分：生物基因组序列比对分析、分子进化
全基因组序列数据的积累,使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。 不同于以往单纯依赖于生物形态学特征,这种分析更加深刻更加本质。利用分子序列 使得我们可以研究,从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。 比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的 基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利 用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病 基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。 目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码 基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其GC%比较高；内含子和外显子 的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一 比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排列顺序的高度保守特 点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。广泛的比较作图可为多个种 所用，建立它们之间的联系框架或系统。
基因组比对软件
Mauve
VISTA
/vista/index.shtml
分子进化
一个最基本的假设是地球上所有物种都 有一个共同的祖先，从这个祖先开始以
数状形式发展，通常称为生命之树
（tree of life）。 分子进化研究的目的：通过序列同源性
的比较，分析序列间的变化进而了解基
因的进化以及生物系统发生的内在规律。 分子进化有两个主要研究对象，以全基 因组序列为研究对象分析物种进化；以 某基因在多个物种的同源序列为研究对 象分析基因的进化