酶的提取及纯化
第三章 酶的提取与分离纯化
第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的提取和分离纯化
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
3.4.2 离心分离
定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
3.3 酶的提取
方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取
使用的溶剂或溶液
提取对象
0.02～0.5mol/L 提取在低浓度盐溶液中溶 盐溶液 解度较大的酶 pH2～6 水溶液
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH8～12 提取在稀碱溶液中溶解度 水溶液 大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 与水混溶的有机 提取与脂质结合牢固或含 溶剂 有较多非极性基团的酶
电场膜分离
扩散膜分离
补充1：四种常用膜分离技术的基本特征
补充2：四种常用膜分离过程的截留特性
3.4.4 层析分离（色谱技术）
定义
是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分 的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在 两个相中。 其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相 则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度 移动，从而达到分离。
酶产品工艺流程
酶产品工艺流程
酶产品是一种广泛应用于工业生产中的高效催化剂。
酶产品可以通过提取、精制和纯化等工艺步骤进行制备。
下面将详细介绍酶产品的工艺流程。
首先是酶的提取步骤。
酶可以从多种来源中提取得到，如微生物、植物和动物等。
对于微生物来源的酶，可以通过培养微生物菌种，然后收集并离心获得菌体。
接着，通过破碎细胞壁、离子交换、凝胶过滤等操作，将酶从细胞中提取出来。
其次是酶的精制步骤。
在提取过程中，酶会伴随着其他杂质存在，需要通过精制步骤进行去除。
首先是固体分离，通过离心、滤网等操作将固体杂质去除。
然后是液体分离，通过超滤、溶液过滤等操作将液体杂质去除。
最后是浓缩和干燥，将酶溶液经过浓缩、喷雾干燥等工艺，得到酶的粗品。
最后是酶的纯化步骤。
粗品酶仍然存在一些不纯的成分，需要进行纯化以提高酶的纯度。
首先是蛋白质分离，通过离子交换、凝胶过滤等操作将酶与其他蛋白质分离。
然后是酶的活性测定与分析，通过比色法、荧光法等方法检测酶的活性。
接着是纯化酶，可以通过柱层析、电泳等操作去除其他杂质，提高酶的纯度。
最后是酶的活性修饰，通过酶的修饰剂，如金属离子、有机物等，来调节酶的活性和稳定性。
总之，酶产品的工艺流程主要包括提取、精制和纯化等步骤。
在整个工艺流程中，需要使用各种不同的设备和试剂来实现对
酶的提取和纯化。
通过这些步骤，可以得到高纯度和高活性的酶产品，用于各种工业生产中的催化反应。
食品酶的提取纯化及其应用研究
食品酶的提取纯化及其应用研究食品酶对于食品加工和制备起到了不可或缺的作用。
在食品工业中，酶的提取纯化及其应用研究一直是一个热门的课题。
本文将介绍食品酶的提取纯化方法及其应用研究的进展。
一、食品酶的提取纯化方法食品酶通常存在于食物中的各种组织和细胞中，因此提取酶的第一步通常是将食材进行初步处理。
对于植物来源的酶，常见的提取方法包括搅拌、高压处理和超声波处理等。
这些方法能够有效破坏细胞壁，释放出酶活性。
而对于动物来源的酶，常用的提取方法包括组织切碎、浸泡和超声波处理等。
在初步处理后，接下来的步骤是对提取液进行纯化。
常用的纯化方法有离心、过滤、膜分离和层析等。
离心是通过离心力将酶分离出含有大量悬浮物的提取液。
过滤则是利用孔径不同的滤膜将酶与其他杂质分离。
膜分离是利用具有特定孔径的膜对酶进行分离纯化。
而层析则是将提取液通过特定吸附剂层析柱，利用对酶有选择性的吸附材料与酶结合，实现酶的纯化。
二、食品酶应用研究的进展1. 食品加工食品酶在食品加工中的应用广泛。
酶能够促进淀粉的分解，使得食品在消化过程中更易被吸收。
同时，酶也能够降解食物中的抗营养物质，提高食品的营养价值。
例如，利用α淀粉酶对米饭进行处理，能够增加米饭的可溶性淀粉含量，提高米饭的品质和养分吸收。
2. 食品贮藏食品酶在食品贮藏中也发挥着重要的作用。
通过添加合适的酶，能够有效延缓食品的腐败过程，延长其保鲜期。
例如，蔬菜水果中的多酚氧化酶是导致其褐变和腐败的主要酶类，将多酚氧化酶抑制剂添加到蔬菜水果中，能够有效延缓其褐变和腐败过程。
3. 食品改良酶在食品改良中的应用有助于提高食品的质量和口感。
以肉类为例，添加肌肉酶能够促进肉类的嫩化和润滑，提高食品口感。
另外，酶还能够改变食品的结构，形成特殊口感的食品，如酶解豆腐和酶解奶酪等。
4. 食品分析酶在食品分析中的应用也得到了广泛研究。
通过测定食品中酶的活性，能够对食品进行快速检测和质量评估。
例如，利用谷氨酸脱氢酶的活性，可以快速检测食品中的谷氨酸含量，评估食品的鲜度和品质。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶的提取与分离纯化
整理课件
19
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
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14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
整理课件
31
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
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36
第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
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1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
选择中性盐应注意的问题 使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而
本身又易去除。 对酶无毒性，应用不受影响。 价格低廉。 废水处理容易。
常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他 常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这 是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是 在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～ 4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度， 远远高于其它盐类：
+
- -+
++
-+- + -+ -
-+
+
-
-+
+
-
-
+
+ +
-3; +
+
-
+--
-
+
-
-+
-
-
+
- +--
+
分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入 盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
Salting-out:
+ +
+
--
+
NH4
A little salting-in effect
4.8 5.0 5.2 5.4 5.6
pH
0.001
0.01
0.1
NaCl concentration (M)
Salting-in
Salting-in:
NaCl
溶
解
KCl
度
Ionic strength
+
+ +
+
- +-
-
+
+=-
-
+- +
-+
+-
-
-
+=--
-
NaCl
+-
-
- ++
- -+
+
+
+
- -+
温度对盐析的影响
温度升高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。 在一般情况下，蛋白质的盐析温度要求不严格，可以在室温下进行，只有某些对温度比较敏 感的酶，要求在低温0-4 ℃下操作。以避免活力的丧失。
盐 析
定义：在酶或蛋白质溶液中加入 中性盐使其沉淀析出的过程
机理 破坏酶蛋白质分子表面水膜 中和酶蛋白质分子表面电荷
盐析法的优点 • 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 • 操作简单，安全。 • 对许多生物活性物质具有稳定作用。
盐析法的缺点 • 沉淀物中含有大量的盐析剂
盐析用中性盐的选择
常用的中性盐 MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4
蛋白质的浓度与盐析的关系
利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋 白质实际浓度有很大关系。 LogC1＝β-KsI1
这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。 但如 果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为C2)， 则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。 (设此时离子强度为I2)应写作： LogC2＝ β-KsI2 Log（C1/C2）＝Ks（I2-I1）
第五章
酶的提取及纯化
酶提取纯化方法
● 1 酶液获得 ● 2 沉淀、萃取方法 ● 3 柱层析分离法 ● 4 电泳
重点掌握：酶液制备的方法、从酶液中提取 酶的方法、酶的制剂化
酶提取纯化总原则
防止酶的变性失活
低温 合适的pH 避免激烈搅拌，减少泡沫 去除重金属、微生物、蛋白酶等
一、酶液的制备
玻璃球 (glass bead), 超声波震荡, French press
一、酶液的制备
4、发酵液的预处理
预处理的目的 改善发酵液的过滤性能，使其更易过滤， 获得澄清的酶液。
预处理的方法 ➢加热 ➢凝聚（Coagulation）和絮凝（Flocculation） ➢助滤剂
一、酶液的制备
5、固液分离 ➢ 过滤 ➢ 离心 ➢ 沉降 ➢ 膜过滤
溶
Ammonium sulfate
解
度
+
-
-
+
SO42-
+ +
+
--
Sodium sulfate
Ionic strength
Aggregate
+
-
- --
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入时， 这些水分子被抽出，以便盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域 相互结合，形成沉淀。
一、酶液的制备
6，酶液浓缩 酶液浓缩的作用
减少盐析剂、有机溶剂用量 减少压滤后的废水量，从而减轻其对周围环境
的污染
酶液浓缩的方法
真空浓缩（刮板薄膜蒸发器、降膜式蒸发器、 升膜式蒸发器）
冰冻浓缩 超滤浓缩
二、酶的提取
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 复合沉淀 双水相萃取 反相胶团萃取
离子强度和类型对盐析的影响
几种蛋白质析出时所需硫酸铵的 离子的强度
蛋白质在不同电解质中的盐析效应
离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响 较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱
pH对盐析的影响
盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。 但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。需根 据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。