酶的提取与分离纯化课件
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酶的分离纯化资料PPT课件
常用的缓冲液：20-50mmol/L的磷酸缓冲液； 0.1mol/L Tris-HCl，必要时可加入 EDTA、巯基乙醇或蛋白稳定剂等
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
9
◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
15
盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
成品加工
5
二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
9
◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
15
盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
成品加工
5
二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
4.12第四章酶的分离纯化
高 速离心 机 的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等 的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高 速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
酶的提取和分离纯化
Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
3.4.2 离心分离
定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
3.3 酶的提取
方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取
使用的溶剂或溶液
提取对象
0.02～0.5mol/L 提取在低浓度盐溶液中溶 盐溶液 解度较大的酶 pH2～6 水溶液
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH8～12 提取在稀碱溶液中溶解度 水溶液 大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 与水混溶的有机 提取与脂质结合牢固或含 溶剂 有较多非极性基团的酶
电场膜分离
扩散膜分离
补充1：四种常用膜分离技术的基本特征
补充2：四种常用膜分离过程的截留特性
3.4.4 层析分离（色谱技术）
定义
是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分 的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在 两个相中。 其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相 则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度 移动，从而达到分离。
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
3.4.2 离心分离
定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
3.3 酶的提取
方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取
使用的溶剂或溶液
提取对象
0.02～0.5mol/L 提取在低浓度盐溶液中溶 盐溶液 解度较大的酶 pH2～6 水溶液
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH8～12 提取在稀碱溶液中溶解度 水溶液 大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 与水混溶的有机 提取与脂质结合牢固或含 溶剂 有较多非极性基团的酶
电场膜分离
扩散膜分离
补充1：四种常用膜分离技术的基本特征
补充2：四种常用膜分离过程的截留特性
3.4.4 层析分离（色谱技术）
定义
是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分 的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在 两个相中。 其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相 则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度 移动，从而达到分离。
酶的提取与分离纯化(1)ppt课件
Size-exclusion chromatography
★
② 凝胶的种类和性质
▼交联葡聚糖凝胶（dextran gel)
商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大， 交联度越小，孔径越大，分离范围越广。
葡聚糖凝胶层析介质的有关参数
微滤 超滤
反渗透
<20A
0.7-13MPa
★
微滤(Microfiltration，MF) 一种静态过滤， 随过滤时间延长，膜 面上截流沉积不溶物， 引起水流阻力增大， 透水速率下降，直至 微孔全被堵塞；
●
原料液
渗透液 无流动操作
●
超滤
(ultrafiltration，UF )
★
一种动态过程，由泵提供推动力，在膜 表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法 向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜 面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。
③ 层析柱的制备与层析操作
●
★
柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
低温层析柜
记录仪
2
吸附层析（adsorption chromatography）
★
①原理:利用固定相的固体吸附剂表面
对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶 解作用（解吸作用）的差异进行分离。
★
③色谱仪组成
1）进样系统 2）输液系统 3）分离系统 4）检测系统 5）数据处理系统
作业:1膜分离的原理﹑有哪些类型 2层析法的原理﹑有哪些类型
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑营：课件设计，文档制作，网络软件设计、 图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满 意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、 计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面， 打造全网一站式需求
大蒜细胞SOD酶的提取和分离(生物分离纯化技术课件)
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
1
产品简介
2
实训目标
3பைடு நூலகம்
实训原理
4
实训试剂与设备
5
生产实训
6
产品检测
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品简介
一、产品简介 SOD是Super Oxide Dismutase 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是
生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微 生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。
lmmol/ L的EDT A 溶液，调pH为8.2。 三、检测器材
试管、吸管、容量瓶、量筒、电子分析天平、比色皿、722型分光光度计 。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品检测 一、检测前准备 二、产品检测
1、检测装运、各种检测用试剂 2、检查检测记录等文件
1、样品 取样品10g(精 确 至0.001)。用水浸泡或溶解定 容至 100ml过滤，取滤液备用 。
SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证 实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细 胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。 由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大 量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
2、采用热变性法对粗酶液进行粗提：将大蒜中 SOD酶液于 60℃ 热处理 20min , 8 500r /min离心 10min ,弃沉淀, 取上清液。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离 生产实训
3、采用丙酮沉淀法进行分离纯化：将酶液置于冰浴中,加入- 18℃ 预冷的丙酮，搅拌 10min，于 4500r/min离心 15min，弃上清液，用 50mmol /L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4℃ 过夜，4500 r/min离心 10min ，测定上清液的 SOD酶活力。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
1
产品简介
2
实训目标
3பைடு நூலகம்
实训原理
4
实训试剂与设备
5
生产实训
6
产品检测
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品简介
一、产品简介 SOD是Super Oxide Dismutase 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是
生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微 生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。
lmmol/ L的EDT A 溶液，调pH为8.2。 三、检测器材
试管、吸管、容量瓶、量筒、电子分析天平、比色皿、722型分光光度计 。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品检测 一、检测前准备 二、产品检测
1、检测装运、各种检测用试剂 2、检查检测记录等文件
1、样品 取样品10g(精 确 至0.001)。用水浸泡或溶解定 容至 100ml过滤，取滤液备用 。
SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证 实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细 胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。 由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大 量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
2、采用热变性法对粗酶液进行粗提：将大蒜中 SOD酶液于 60℃ 热处理 20min , 8 500r /min离心 10min ,弃沉淀, 取上清液。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离 生产实训
3、采用丙酮沉淀法进行分离纯化：将酶液置于冰浴中,加入- 18℃ 预冷的丙酮，搅拌 10min，于 4500r/min离心 15min，弃上清液，用 50mmol /L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4℃ 过夜，4500 r/min离心 10min ，测定上清液的 SOD酶活力。
酶的提取与分离纯化幻灯片PPT
硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇
羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素
聚乙二醇（PEG） 磷酸钾、硫酸铵
硫酸钠、硫酸镁
②萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。
③应用 胞内酶的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
菌种
相系统
延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐
天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐
-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex
乙醇脱氢酶 Baker’s yeast PEG/ 盐
青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐
双水相萃取法的重要研究方向
--亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分
解或溶解度小的物质分开。 降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶
解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。
●常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为： 液体CO2无毒 临界温度（304.06K）接近常温 临界压力（7.38MPa）较低 操作安全
超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用
CO2萃取部分产品
V=V0—S—12--—SS12—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
★
⑵添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的
盐浓度又Байду номын сангаас高时。
按下式计算，得表中数据
W=
B(S2-S1) —1-—AS—2 ———
A,B——常数，与温度有关。
酶的提取与分离纯化
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
整理课件
19
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
整理课件
14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
整理课件
31
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
整理课件
36
第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
整理课件
19
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
整理课件
14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
整理课件
31
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
整理课件
36
第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
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提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
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提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
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第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
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酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
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(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
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二、细胞破碎（胞内酶）
（一）细胞壁组成
细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌: 多糖（几丁质和葡聚糖）
即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一 般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm
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2. 沉降系数:（sedimentation constant）
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各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
物
细菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚 /nm
层次
15 ~ 50 单层
10 ~ 13 同G+ 多层
100 ~ 300 多层
100 ~ 250 多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖 (5% ~ 10%)
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
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四、 离心分离
三种形式： 1）离心沉降 2）离心过滤 3）离心分离和超离心
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（一）基本原理
1. 离心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，
指单位离心力下颗粒的沉降速度 （sedimentation velocity）,用S表示。
由于许多生物大分子的S值很小，所以定 义10 13 s 为一个沉降单位，1S = 11013 s。
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
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实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
使用超速离心机时 先抽真空。
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离心的形式
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
纯化工艺评价
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基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程
第一节 酶的分离
一、发酵液预处理
目的：
提高固液分离效率 使产物转移用于后处理相中 去除部分杂质
(一)发酵液的相对纯化
1. 无机离子的去除 （降低离子强度、酶活性影响） 2. 杂蛋白质的去除 （沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附） 3. 色素及其他物质的去除
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（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
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离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
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3.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。
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4. 化学法
应用各种化学试剂与细胞膜作用， 使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
（二）细胞破碎的方法
机械法 机械捣碎法 研磨破碎法 匀浆破碎法 高压匀浆法 超声破碎法
非机械法 酶法 化学法 物理法 干燥法
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1.机械法：
1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 3）超声波破碎法。 2. 非机械法——物理法 1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力：
测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，
估算破碎率。
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三、酶的提取(extraction)
把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
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破菌
分离策略
Intact membrane a Detergent
➢ 酶法+高压匀浆/超声
➢ 盐及表面活性剂
Detergent
➢ 低浓度的变性剂
Detergent-solubilized proteins
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（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；