CRISPR-Cas9基因敲除小鼠
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为一种强大的工具，用于在生物医学研究中精确地编辑基因组。
DUSP9基因作为一种重要的基因，其功能在多种生物学过程中起着关键作用。
因此，构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，对于研究DUSP9基因的功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。
本文旨在详细介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程。
二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞（mESCs）、CRISPR-Cas9系统、相关基因编辑工具、培养基、生长因子等。
2. 方法（1）设计CRISPR-Cas9系统：根据DUSP9基因的序列信息，设计合适的CRISPR-Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
（2）制备mESCs细胞：培养mESCs细胞至合适的状态，以便进行基因编辑。
（3）转染与编辑：将CRISPR-Cas9系统转染至mESCs细胞中，利用Cas9蛋白对DUSP9基因进行切割。
（4）筛选与鉴定：通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法，筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并进行鉴定。
三、实验过程1. 设计并构建CRISPR-Cas9系统，选择合适的sgRNA序列和Cas9蛋白表达载体。
2. 培养mESCs细胞至合适的状态，进行转染。
3. 观察转染后的细胞生长情况，确保Cas9蛋白的表达。
4. 利用PCR、Western blot、qRT-PCR等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞。
5. 对筛选出的细胞进行扩增培养，并保存于液氮中备用。
四、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了CRISPR-Cas9系统，并将其转染至mESCs 细胞中。
（2）成功筛选出敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法进行了鉴定。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。
它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。
二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。
2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。
三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。
通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。
2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。
3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。
随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。
4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。
将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。
四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。
基于CRISPRCas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建
38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。
方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。
结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。
结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。
关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究领域，基因编辑技术日益显示出其巨大的潜力和应用前景。
CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已在多个物种中成功用于构建基因敲除模型。
本文旨在介绍如何利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）小鼠胚胎干细胞（mESCs）；（2）CRISPR-Cas9系统相关试剂；（3）DUSP9基因敲除载体；（4）显微操作设备及试剂；（5）实验动物（小鼠）。
2. 方法（1）设计并构建DUSP9基因敲除载体；（2）将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂；（3）利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复，形成基因敲除突变；（4）筛选并扩增基因敲除的mESCs；（5）将基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，生成转基因小鼠。
三、实验过程1. 载体构建及转染首先，设计并构建DUSP9基因敲除载体。
该载体应包含靶向DUSP9基因的识别序列、切割位点及修复模板。
随后，将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂。
此过程需在显微操作下进行，确保转染效率和准确性。
2. CRISPR-Cas9系统修复及筛选利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复。
通过非同源末端连接或同源重组等方式，使基因发生突变，形成DUSP9基因敲除的突变体。
随后，通过PCR、测序等方法筛选并扩增基因敲除的mESCs。
3. 转基因小鼠生成及鉴定将扩增得到的基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，通过胚胎移植技术生成转基因小鼠。
随后，通过PCR、免疫组化等方法对转基因小鼠进行鉴定，确认DUSP9基因是否成功敲除。
四、结果与讨论1. 结果利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除的小鼠胚胎干细胞系。
通过PCR、测序等方法验证了DUSP9基因的敲除效率及准确性。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究中，基因敲除是一种重要的技术手段，能够精确地操控特定基因的表达，进而研究基因在生物体中的功能。
近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因敲除技术得到了极大的推进。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和步骤，为进一步研究DUSP9基因的功能提供技术支持。
二、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，具有高效、精确的基因编辑能力。
该系统通过设计特定的RNA 引导序列与Cas9蛋白结合，形成复合物，识别并切割靶点DNA 序列，从而实现基因的敲入、敲除或替换等操作。
三、DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的构建1. 靶点设计：首先需要确定DUSP9基因的敲除靶点，设计相应的sgRNA和Cas9蛋白序列。
通过分析DUSP9基因的序列，找到合适的位置作为靶点。
2. 胚胎干细胞系的获取：选取适合的小鼠胚胎干细胞系，确保其处于稳定的生长状态。
3. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑：将设计好的sgRNA和Cas9蛋白通过特定的方式（如质粒转染、病毒载体等）引入小鼠胚胎干细胞中。
在细胞内，sgRNA和Cas9蛋白形成复合物，识别并切割DUSP9基因的靶点。
4. 克隆筛选和鉴定：经过一段时间的培养和筛选，挑选出发生基因突变的小鼠胚胎干细胞克隆。
通过PCR、测序等分子生物学手段，鉴定克隆中DUSP9基因的敲除情况。
5. 细胞系建立：将鉴定成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞进行传代培养，建立稳定的细胞系。
四、实验结果与讨论通过上述步骤，我们成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系。
在实验过程中，我们观察到CRISPR-Cas9系统对DUSP9基因的切割效率较高，成功获得了多株基因敲除克隆。
《基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠》
《基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠》基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠一、引言近年来，基因编辑技术在生物学及医学研究领域取得了重大突破。
其中，CRISPR/Cas9技术以其高效、精确的基因编辑能力，在构建基因敲除模型、研究基因功能以及疾病机制等方面发挥了重要作用。
本文旨在介绍基于CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠的实验过程、结果及分析。
二、材料与方法1. 材料（1）细胞系：选择适合进行基因编辑的细胞系。
（2）小鼠：选择适合的实验用小鼠。
（3）CRISPR/Cas9系统：包括Cas9蛋白、sgRNA等。
（4）实验试剂与设备：包括细胞培养试剂、PCR仪、显微镜等。
2. 方法（1）设计并合成针对KDM2A和S100A9基因的sgRNA。
（2）构建CRISPR/Cas9表达载体。
（3）将表达载体转染至细胞系或小鼠胚胎中。
（4）筛选并扩增基因敲除细胞系或小鼠。
（5）通过PCR、 Western blot等方法验证基因敲除效果。
三、实验结果1. KDM2A基因敲除细胞系的构建与验证（1）成功构建了针对KDM2A基因的CRISPR/Cas9表达载体，并转染至细胞系中。
（2）通过PCR和Western blot等方法，验证了KDM2A基因的成功敲除。
（3）KDM2A基因敲除细胞系在体外培养过程中表现出特定的生物学特性改变。
2. S100A9基因敲除小鼠的构建与验证（1）将CRISPR/Cas9表达载体注射至小鼠胚胎中，成功获得了S100A9基因敲除小鼠。
（2）通过PCR等方法，验证了S100A9基因的成功敲除。
（3）S100A9基因敲除小鼠在生长过程中表现出特定的表型变化。
四、讨论与分析1. KDM2A基因敲除细胞系的分析KDM2A是一种组蛋白去甲基酶，参与调控基因表达和细胞周期等过程。
CRISPR_Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠_谷振阳
基因第三外显子碱基序列，设计针对 S1PＲ5 基因的 sgＲNA（ single guide ＲNA） ，构建 sgＲNA 表达质粒，利用 T7 ＲNA
聚合酶体外转录 sgＲNA 和 Cas9 后，将 Cas9 mＲNA 和 sgＲNA 对 C57BL /6 小鼠的受精卵进行显微注射。使用 T7E1
S1PＲ5 表达的 qPCＲ 及 Wstern blot 检测 颈椎脱臼法处死 F2 代 S1PＲ5 － / － 的 C57BL /6 小鼠 和野生型小鼠，后分别取出的脾脏，40 μm 滤网中充 分研磨脾脏，收集脾脏细胞悬液，离心后，裂解红细 胞。后收集脾脏细胞，提取总 ＲNA 和总蛋白，并逆 转录获得 cDNA，作为模板。利用引物 ＲT-S1PＲ5 － F： 5'-CTACAACTACACCGGCAAGC-3'，ＲT-S1PＲ5 － Ｒ： 5'-TAGGATGTTGGTGGCGTAGG-3'，扩增目的基 因。以 GAPDH 作为内参，比较 S1PＲ5 － / － 小鼠与野 生型小鼠中 S1PＲ5 在 mＲNA 水平的表达情况。以 S1PＲ5 的抗体（ Abcam 公司） ，actin 为内参，比较两 种小鼠中 S1PＲ5 在蛋白水平的表达情况。
基金项目： 国家自然科学基金面上项目（ 81270642） # 谷振阳和赵小利为共同第一作者． * 通讯作者： 高春记，主任医师，教授，博士生导师． E-mail： gaochunji @ hotmail． com 2015 － 09 － 01 收稿； 2015 － 11 － 11 接受
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材料和方法
质粒构建 C57BL /6 小鼠中 S1PＲ5 基因 exon3 外显子上选择 sgＲNA（ single guide ＲNA） 靶点，共设计 4 条 sgＲNA， 分 别 是 S1PＲ5 （ 1 ） － sgＲNA： 5'-ATAACCTCACTC ACCGGCGC-3'，S1PＲ5（ 2） － sgＲNA： 5'-CTACACCGGCAAGCTCCGCG-3'，S1PＲ5 （ 3 ） － sgＲNA： 5'-AAC ATGGGCGCATGGAAGCG-3'，S1PＲ5 （ 4 ） － sgＲNA： 5'-TTTGTCGGACCTGCTCGCCG-3'，然后合成含此 4 种 sgＲNA 的双 链 寡 核 苷 酸 链，连 入 经 酶 切 回 收 的 sgＲNA 表达载体，构建 sgＲNA 表达载体。测序验证 连入的片段是否正确，后选择正确的克隆，培养后提 取质粒，作为体外转录的模板。此过程由南京大学 － 南京生物医药研究院负责实施。
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2015-2-5
8
一、慢病毒转入树突状细胞
——转入树突状细胞实验过程
2015-2-5 9
通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功设计了两个剪切位点
2015-2-5 11
有转入目的基因 的小鼠大多细胞目的 基因发生移码突变， 目的基因转录和翻译 都明显下调。
2015-2-5 12
2015-2-5
26
Thanks！
2015-2-5
2
CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
target
2015-2-5
3
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。 • 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。 • 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
2015-2-5
4
Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转 录可被诱导
2015-2-5
荧光蛋白
5
转入Cas9后与野生小鼠对比
2015-2-5
6
神经系统荧光对比
2015-2-5 7
三种实验测试效果：
三种转接方法： 纳米粒子、腺病毒转导、 慢病毒转导。 三个系统（器官）： 免疫、神经、肺（癌）。
二、腺病毒转入大脑皮层额叶
目标基因是NeuN
2015-2-5
13
目的基因发生的改变
缺失一位 缺失多位 插入一位 插入多位
2015-2-5
14
荧光显示含有Cre/Cas9 的组织中NeuN表达明显减 少，而非转入非目标的 sgRNA则目标蛋白无影响
2015-2-5 15
NeuN被破坏的比例十分大
• 多为移码突变
2015-2-5
20
Lkb1的基因变化
• 多为移码突变
2015-2-5
21
Kras的基因变化
2015-2-5
22
P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发优势
2015-2-5 23
最终肺中出现肿瘤
2015-2-5
24
2015-2-5
25
总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。 • 以后用此方法可以更好的对基因进行修整， 已达成更多的实验，为人类医学和生物学作 出贡献。
CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling
CRISPR-Cas9系统的原理
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基 配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ） 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引 导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶 位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA， 可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割。
Indel=insertions(插入) and deletions(删除) 2015-2-5 16
多数为两个等位基因都被破坏，且其 中多为移码突变。
2015-2-5 17
三、腺病毒转入肺
2015-2-5
18
sgKras
sgp53
sgLkb1
Kras同源 修补
2015-2-5
19
P53的基因变化