第七章 发酵异常情况分析处理与防治
第七章发酵染菌及防治
２、噬菌体检查——双层平板培养法：
底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量 ，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后 ，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作 为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板 上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。
微生物的浓度过低，发酵液转稀： 指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。 （1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。 （2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。 未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可
。 微生物的浓度过高，发酵液过浓： （1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发
酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。 （2）措施：补入大量的水。
二、染菌检查（p185-186）
在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、 及时处理，是免除染菌造成严重损失的重 要手段。因此，要求有确切、迅速的方法 来检测出污染的杂菌。
目前常用的方法：
（一）显微镜检查 （二）肉汤培养检查法 （三）平板划线培养或斜面培养检查法 （四）发酵过程的异常现象观察法
发酵染菌批数
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
总染菌率=——————100％
总投料批数
发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染 菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的 染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
（二）染菌原因及分析
归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面： 无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌
不彻底、操作失误和技术管理不善等。 但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌
（四）发酵过程的异常现象观察法 （p186）
如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、 菌体酶活力等变化来判断。
第七章发酵生产染菌及其防治
（1）、噬菌体的防治
是一项系统工程，从培养基制备灭菌、种子培 养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道等诸多 方面，具体归纳如下： ① 严格活菌体排放，切断噬菌体的来源 ②做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌 ③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内
④抑制罐内噬菌体的生长
（2）、污染噬菌Biblioteka 后的处理方法①并罐法三、发酵染菌原因分析 发酵的染菌率（指一年内发酵染菌批数与总 投料批数之比） 总染菌率 ＝ 发酵染菌批数 总投料批数 ×100％
染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、 发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水 平等有关。
染菌原因分析 染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未 然。 主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，设 备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。
四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防 止
设备渗漏：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门 等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作 不良等形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
“死角”：由于操作、设备结构、安装及其他人为因 素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、 空气分布管、发酵罐部件、管件等。
（1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）：观
察微生物的形态特征，检查是否有与菌种形态特征不 一样的其他微生物在存在。 （2）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温24小时，确定无菌；划线后分 别于37、27培养，一般24h后镜检是否有杂菌。
（3）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4） 样品直接接入灭菌的肉汤培养基中，分别于37、 27培养，随时观察，并取样镜检。 噬菌体检测时，用双层平板法，底层为肉汤培养 基，上层琼脂减量，指示菌为生产菌。
第七章
第七章 发酵异常情况分析处理与防治
term
盘管穿孔
搅拌轴密封渗漏 发酵罐盖漏 阀门渗漏 培养基灭菌不透
泡沫冒顶
接种管穿孔 接种时罐压跌零
5 10 15 20 25 30
100 %
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染菌原因分析
10 9 8 7 6
原因不明
空气系统有菌
接种 外界带入杂菌 设备穿孔 管理问题 操作违反规程 停电罐压跌零
噬菌体：感染细菌或放线菌的一种病毒；
危害：噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治； 噬菌体在自然界中分布很广，在土壤、腐烂的有机物和空气 中均有存在。 染菌方式：噬菌体直径约0.1mm，可以通过环境污染、设备的 渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌不彻底、菌种带进 噬菌体或本身是病源性菌株、补料过程及操作失误等途径使 发酵染菌； 噬菌体感染的三要素：噬菌体、活菌体、噬菌体与活菌体接 触的机会和适宜的环境（噬菌体脱离寄主菌体不能自行生长 繁殖）；
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防治培养基灭菌不彻底的措施
淀粉质培养基在升温前先进行搅拌混合均匀，并加入一定量的 淀粉酶进行液化； 对于固形物含量较多的培养基，先在罐外配料，再转至发酵罐 内进行实罐灭菌； 灭菌升温时，要打开排气阀门，彻底排除空气；
适量添加消泡剂防止泡沫的大量产生；
菌株保藏器具的无菌保证； 对菌种培养基进行严格的灭菌处理； 对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查；
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染菌原因之二：空气带菌
影响：无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。
可能原因： 空气的净化流程和设备的设计和安装不当，存在泄露；
过滤介质的选用和装填不当；
发酵过程中异常情况及解决措施
发酵过程中异常情况及解决措施金星集团信阳啤酒有限公司黄华龙465100 发酵液的澄清是一种自然的凝聚、沉降悬浮颗粒（包括酵母、冷凝固物等）的过程，这是一种简单但由耗时比较长的形式，这种自然沉降遵循斯托克斯定律（球形物体在流体中运动所受到的阻力，等于该球形物体的半径、速度、流体的黏度与6π的乘积）。
这个定律叫做斯托克斯定律：如果物体在流体中因自身的重量而下落，根据上面公式，则为最终速度。
）从上式中可以看出，发酵液的澄清即悬浮混浊颗粒的沉降，受混浊颗粒的大小和液体黏度的影响较大，因此，要加速发酵液的澄清，必须设法去减小液体的黏度，增加混浊颗粒相互凝聚成大颗粒的机会。
其次，对自然澄清的形式来说，液体中混浊颗粒的沉降还与沉降的距离、液体的运动程度有关，因为液体的不规则运动和较大的沉降距离都不利于颗粒的沉降，因此贮酒时的静止、罐的直径或高度都是发酵液澄清的重要条件。
1、贮酒期发酵液澄清不好的原因：经过规定时间的静止贮酒以后，发酵液仍然混浊不清，造成这种现象的主要原因有：a)原料质量差（麦芽溶解度差），糖化效果不良，带入后发酵许多胶黏性物质（如葡聚糖、糊精等），导致发酵液的黏度较高，影响颗粒物质的沉降；b)贮酒酒龄太短，凝固物颗粒与酵母沉降时间不足；c)升温糖度提前，导致大量的混浊物质和酵母悬浮，随着温度的不断降低，冷凝固物细粒不断析出，但没有能凝聚成较大颗粒物质沉降；d)封罐糖度偏高，酵母细胞数偏多，导致后发酵持续时间较长，液体处于运动状态，混浊颗粒不易沉降；e)发酵温度偏高，发酵液PH偏高，都会影响冷混浊等颗粒物质的凝聚沉降，较高的PH还会使发酵液黏度有所上升，影响澄清；f)酵母凝聚性能太差，发酵度太低，制麦过程和糖化过程中蛋白质分解程度不足，或是去除冷、热凝固物效率太低，都会影响发酵液的澄清；g)麦汁或发酵液污染杂菌，发酵液酸化，会使部分凝固物颗粒带有相斥电荷，不能凝聚沉降；h)添加高泡酒的发酵液静置时间太短。
第七章 发酵染菌及防治
无菌试验要严格取样操作，力求减少误差。
应同时用肉汤和双碟作对照，以便迅速作出判断。
当发现染菌时，要通过分辨菌型来探索菌源，并对杂菌
做耐热试验考察。
如果怀疑种子罐染菌，则种子不能轻率进发酵罐。
《发酵工程》
第七章 发酵染菌及防治
3、 无菌检查与染菌的处理
为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌，在接种前 后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查，以便及时 （1）无菌检查 发现染菌，并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。 染菌通常通过3个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜 检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要 依据。
废弃的发酵液处理不当可以成为难以对付的污
染源。
《发酵工程》 2、 噬菌体污染与发酵异常
第七章 发酵染菌及防治
噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、 污染的噬菌体特性、污染时间、感染复度（即培
养物内的噬菌体与细菌的比率）、培养基成分、
发酵罐内的物理和化学条件不同而异。即使同样 的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵情况。
《发酵工程》
项目 百分率%
进罐前未做设备严密度检查
接种违反操作规程
25.8
25.8
检修质量缺乏验收制度
操作不熟练
19.35
19.35
配料违反工艺规程
调度不当
6.45
3.25
《发酵工程》
（4）染菌的处理
第七章 发酵染菌及防治
发现染菌后，应立即根据染菌的种类及产生菌的菌龄等 具体情况分别进行处理。除据染菌时间及危害程度对污染 种子罐染菌后，种子不能再接入发酵罐中，这时可用备用 罐进行挽救或处理外，对有关设备也应进行处理。 种子接种。如无备用种子，则可选一适当培养龄的发酵罐培 养物作种子，即生产上所说的“倒种”。 发酵罐前期染菌后，如培养基中C、N含量尚高，则可重新 灭菌，接种后再运转；若染的杂菌危害性较大，则放掉部分 料液，补入新料液，重新灭菌、接种。 发酵中后期染菌或前期染菌轻微而发现较晚时，可加入适 当的杀菌剂或抗生素；或把高单位的后期发酵液压一部分到染 菌罐中，抑制杂菌生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速 度。
(整理)发酵过程中异常情况及解决措施
发酵过程中异常情况及解决措施金星集团信阳啤酒有限公司黄华龙465100 发酵液的澄清是一种自然的凝聚、沉降悬浮颗粒（包括酵母、冷凝固物等）的过程，这是一种简单但由耗时比较长的形式，这种自然沉降遵循斯托克斯定律（球形物体在流体中运动所受到的阻力，等于该球形物体的半径、速度、流体的黏度与6π的乘积）。
这个定律叫做斯托克斯定律：如果物体在流体中因自身的重量而下落，根据上面公式，则为最终速度。
）从上式中可以看出，发酵液的澄清即悬浮混浊颗粒的沉降，受混浊颗粒的大小和液体黏度的影响较大，因此，要加速发酵液的澄清，必须设法去减小液体的黏度，增加混浊颗粒相互凝聚成大颗粒的机会。
其次，对自然澄清的形式来说，液体中混浊颗粒的沉降还与沉降的距离、液体的运动程度有关，因为液体的不规则运动和较大的沉降距离都不利于颗粒的沉降，因此贮酒时的静止、罐的直径或高度都是发酵液澄清的重要条件。
1、贮酒期发酵液澄清不好的原因：经过规定时间的静止贮酒以后，发酵液仍然混浊不清，造成这种现象的主要原因有：a)原料质量差（麦芽溶解度差），糖化效果不良，带入后发酵许多胶黏性物质（如葡聚糖、糊精等），导致发酵液的黏度较高，影响颗粒物质的沉降；b)贮酒酒龄太短，凝固物颗粒与酵母沉降时间不足；c)升温糖度提前，导致大量的混浊物质和酵母悬浮，随着温度的不断降低，冷凝固物细粒不断析出，但没有能凝聚成较大颗粒物质沉降；d)封罐糖度偏高，酵母细胞数偏多，导致后发酵持续时间较长，液体处于运动状态，混浊颗粒不易沉降；e)发酵温度偏高，发酵液PH偏高，都会影响冷混浊等颗粒物质的凝聚沉降，较高的PH还会使发酵液黏度有所上升，影响澄清；f)酵母凝聚性能太差，发酵度太低，制麦过程和糖化过程中蛋白质分解程度不足，或是去除冷、热凝固物效率太低，都会影响发酵液的澄清；g)麦汁或发酵液污染杂菌，发酵液酸化，会使部分凝固物颗粒带有相斥电荷，不能凝聚沉降；h)添加高泡酒的发酵液静置时间太短。
影响啤酒酵母发酵的异常因素及其防治
影响啤酒酵母发酵的异常因素及其防治酵母是啤酒发酵的灵魂，酵母质量的优劣直接关系到啤酒质量的好坏。
产品质量是企业的生命，是企业长期发展的基石。
在啤酒的生产过程中，酵母的性能和管理在啤酒生产中占着举足轻重的作用。
做好酵母管理，提高酵母质量，酿造高质量的啤酒并保持产品稳定是我们所追求的目标。
酵母性能很大程度上影响着啤酒酿造工艺的控制，对啤酒品质起着非常重要的作用。
保持接种酵母有旺盛的发酵力是保证啤酒质量稳定的前提，生产酵母一旦发生退化或发酵表现异常，就会影响啤酒酿造工艺的控制和啤酒质量的稳定。
鉴于啤酒酵母对啤酒质量有如此的重要性，如何防止酵母退化，如何预防和控制发酵异常，是我们啤酒厂应时刻关注的问题，应把酵母扩培、酵母管理给予足够的重视。
一、酵母发酵异常的原因由于环境因素的影响，往往造成酵母细胞机能的衰退。
如麦汁营养不良等因素，造成酵母退化突变，造成发酵异常，也会造成酵母细胞的死亡，导致酵母自容量的增加。
酵母的变异会造成各种性能的转变。
以下从酵母菌种、麦汁营养成分、发酵过程控制三方面谈谈原因。
㈠酵母菌种1.凝聚性受遗传基因和细胞膜的结构影响，跟酵母的类型有关。
是一种酵母细胞本身生理机能的衰退。
2.菌种保存条件不好，如培养基干燥，将引起酵母菌种的退化。
3.保种温度升高，也将引起酵母菌种退化。
温度越高，高温时间越长，菌种退化越严重。
4.保菌不当，营养丰富致使酵母长得过分肥大，易衰退。
5.有些酵母代数升高，凝聚性较强。
6.留种酵母急着用于扩培，造成代谢慢，易衰老。
7.汉生罐留种量多，新酵母少，酵母易衰老。
㈡麦汁营养成分1.麦汁过滤布合理，蛋白质，多酚(或树脂)复合物、酒花中的多酚(单宁)等高分子会大量进入发酵罐，造成酵母吸附成团。
2.麦汁营养组成不合理，导致代谢慢，酵母易衰老，突变机会多。
3.麦汁中的凝固物去除不好。
麦汁中带正电荷的蛋白质、类脂、葡聚糖小颗粒的物质与带负电荷的酵母互相作用形成紧密的凝聚物，酵母易早衰。
7第七章.发酵过程的中间控制
四环素生 物合成过 程中系列 参数的动 态变化过 程
1：效价； 2：呼吸强 度；3：生 物热；4： 糖浓度
2. 搅拌热（ Q搅拌）
• 通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成 液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热 。 Q搅拌=3600×（P/V） 3600：热功当量（kJ/（kW.h）） （P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的 功率（ kW/m3）
3. 蒸发热（ Q蒸发）
• 通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控 制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后， 就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会 引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。 • 蒸发热的计算： Q蒸发=G（I2-I1） G：空气流量，按干重计算，kg/h I1 、 I2 ：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg （干空气）
五、温度的控制
发酵罐：夹套（10M3以下） 盘管（蛇管） （10M3以上）
冷却介质：深井水或冷冻水 控制方式：手动控制或自动控制
温度 计
调节阀 温度控制器
第二节、 pH对发酵的影响及控制
• 尽管多数微生物能在3～4个pH单位的pH范 围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到 高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在 很窄的范围内保持恒定。
四，最适温度的选择 最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最 适于菌的生长或发酵产物的生成。 最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件 和菌体生长阶段有关。 最适发酵温度的选择
–根据发酵阶段的不同，选择不同的培养温度。 –参考其它发酵条件来选择温度。 –温度的选择还应考虑培养基成分和浓度
三、最适PH值的选择和调节
1. 最适PH值的选择
原则：有利于菌体生长和产物的合 成。一般根据实验结果确定。
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种子培养异常
表现：菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化和代谢异常；
危害：培养的种子不合格，影响后续发酵的正常进行；
可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：
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无菌试验期间应每六小时观察一次无菌试验样品，以便能及早 发现染菌。
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染菌的原因与防治
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染菌原因分析
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
原因不明 总空气系统有菌
操作问题
夹套穿孔 其他设备渗漏 种子带菌或怀疑种子带菌
四环素发酵：双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌；
柠檬酸发酵：青霉菌； 谷氨酸发酵：噬菌体； 染菌时间和染菌程度的影响； 种子培养期； 发酵前期； 发酵中期；
发酵后期；
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染菌的处置策略：种子染菌
染菌种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并 对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌；
term
盘管穿孔
搅拌轴密封渗漏 发酵罐盖漏 阀门渗漏 培养基灭菌不透
泡沫冒顶
接种管穿孔 接种时罐压跌零
5 10 15 20 25 30
100 %
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染菌原因分析
10 9 8 7 6
原因不明
空气系统有菌
2
1
3
谷氨酸的溶解氧变化曲线 1.正常发酵溶解氧曲线; 2. 异常发酵溶解氧曲线 3.异常发酵光密度值 浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌判断：溶解氧异常
感染好气性杂菌：溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至
接近于零，且在长时间内不能回升；
感染非好气性杂菌：生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧 量减少，溶解氧升高；
染菌的检查和判断
以无菌试验和平板培养为主，其它方法为辅；
如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混 浊，或平板培养连续三次发现有杂菌菌落的出现，即可判断为 染菌。 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确 有可疑的染菌反应，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有 相同类型的杂菌存在，也应该判断为染菌；
废弃前应加热至120℃以上、灭菌30min后才能排放;
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染菌的处置策略：设备处理
放罐后进行彻底清洗，空罐加热至120℃以上、灭菌30min；
或甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12小时以上；
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染菌的检查与判断
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染菌判断：尾气CO2含量异常
好气性发酵产生的CO2量与糖代谢有关，因此尾气中CO2含量
的变化看反映菌体的生长代谢情况；
杂菌污染如果使糖耗加快，则CO2含量增加；反之则降低； 噬菌体污染后，菌体生长受到抑制，糖耗减慢，CO2含量降低；
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第七章 发酵异常情况的分析与防治
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发酵的异常现象
什么是发酵异常情况：发酵液的物理参数、化学参数或 生物参数发生与正常情况不同的改变，并影响发酵水平， 使生产蒙受损失的情况；
发酵异常情况的类型：种子异常、发酵异常；
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有备用种子：采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入 发酵罐，继续进行发酵生产； 无备用种子：则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为 种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从 而保证发酵生产的正常进行；
பைடு நூலகம்浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的处置策略：发酵前期染菌
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染菌对发酵的影响及处置
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染菌对发酵的影响
染菌对不同发酵过程的普遍性影响： 营养物质被杂菌消耗，菌体生长受到抑制，生物量和产物产量偏低； 产物被杂菌分解、严重时得不到产物：青霉素发酵； 不同染菌情况对不同发酵过程还有特殊的影响： 青霉素发酵：细短产气杆菌；
染菌的检查和判断
判断方法：无菌试验
① 显微镜镜检法； ② 肉汤培养法；
③ 平板划线培养或斜面培养检查法；
④ 发酵过程的异常现象观察法：溶氧、尾气组成、pH值、耗糖、 （闻）气味、（看）颜色、；
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染菌判断：溶解氧异常
感染噬菌体后，生产 菌的呼吸作用受到抑 制，溶解氧浓度很快 上升； 感染噬菌体后，溶解 氧的变化比菌体浓度 更灵敏，能更好地预 见染菌的发生。
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染菌的处置策略：发酵中、后期染菌
发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加 入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生 长速度; 也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等 其他措施，进行处理;
如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产品的含量若达 一定值，只要明确是染菌也可放罐;
发酵异常
表现：菌体生长差、菌体生物量异常、菌体形态、pH值异常、 发酵液流动性黏度异常、泡沫过多、营养物质消耗异常等； 危害：无法达到期望的发酵目标； 可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：发酵过程中生产菌以外的菌株侵入发酵液并进行繁殖；
若培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基 加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵； 若培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液， 补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，在接种进行发酵； 也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措 施进行处理；