中药壁虎抗肿瘤作用的实验研究

中药壁虎抗肿瘤作用的实验研究

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：刘菲，王建刚，席守民，马晓娟

【摘要】目的探讨中药壁虎抗肿瘤作用及其作用机制。方法建立移植瘤小鼠S180肉瘤模型,将50只雌鼠随机分为对照组、环磷酰胺组、壁虎高组、中组、低组共5组，分别给于生理盐水灌胃1次/d，CTX（100 mg/kg）腹腔注射1次，壁虎高、中、低组（13.5，9，4.5 g/kg），每天灌胃1次。14 d后,称取荷瘤小鼠瘤重、胸腺重、脾脏重，计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数，观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞实验指标；用SABC免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的蛋白表达，TUNEL方法检测细胞凋亡率。结果中药壁虎可抑制小鼠肉瘤S180 生长，高、中、低组抑瘤率可达49.8%，52.8%，43.1%；对免疫器官无影响；可降低肿瘤组织VEGF，bFGF蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。结论中药壁虎有抗肿瘤活性，其抗肿瘤的部分作用可能通过诱导肿瘤细胞的凋亡及抑制肿瘤血管的生成而实现。

【关键词】中药壁虎小鼠肉瘤S180 血管内皮生长因子碱性成

纤维细胞生长因子

Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumor action of Gecko and its mechanism.MethodsThe transplanted tumor model of the mouse S180 sarcoma was established.Fifty mice were randomly divided into five groups,the control group,the CTX group,the Gecko group(high dose,middle dose,low dose).They were treated respectively with oral administration of saline,and intraperitoneal injection of CTX 100 mg/kg only one time,oral administration of Gecko in doses of 13.5，9，4.5 g/kg,one time a day.After 14 days,the anti-tumor activity was evaluated by tumor tissue weighing. The impact on immune organ was detected by accounting thymus index, spleen index and the number of peritoneal macrophage which phagocytose chicken red blood cells.The protein express of vascular endothelin growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) were detected by SABC immunohistochemistry. The cell apoptotic rate was detected by TUNEL method.ResultsChinese medicine Gecko could obviously inhibit S180 sarcoma of mice,the inhibiting rate was 49.8%,52.8%,43.1% ,it had no impact on immune organ.It could reduce VEGF and bFGF protein expression in tumor tissue and induce tumor cell apoptosis.ConclusionChinese medicine Gecko has anti-tumor activity and its mechanism might be related to

induction of tumor cell apoptosis and the down-regulation of protein expression of VEGF and bFGF.

Key words：Chinese medicine Gecko；S180 sarcoma of mouse；Vascular endothelin growth factor；Basic fibroblast growth factor

壁虎又称为守宫、天龙等。为壁虎科动物无蹼壁虎或多痣壁虎，多疣壁虎及其它几种壁虎的干燥全体，壁虎产于全国各地，性味寒，主要成分含马蜂毒类物质及组织胺类、蛋白质等，有攻毒疗疮、散结止疼、活血化瘀之效。近年来多作丸、散、膏等剂型入药，临床多用于恶性肿瘤的治疗［1］。本文旨在用移植性肿瘤整体动物研究方法，观察中药壁虎的抗肿瘤活性及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

中药壁虎购自安徽省亳州市永刚饮片厂有限公司。将壁虎干燥全体研磨成细粉干燥保存。用0.2%羧甲基纤维素将壁虎粉稀释成混悬液备用。环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号H32020857)。细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL法），VEGF、bFGF免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1. 1. 2 动物及瘤株试验所用昆明种小鼠由河南省医学实验动物中心提供（合格证：0001350 ），体重（26±2）g，均为雌鼠。小

鼠S180肉瘤的种鼠由河南省医科所提供。

1. 2 方法

1.2.1 中药壁虎对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察无菌抽取接种7 d 的小鼠S180腹水，用生理盐水稀释成8 ×106·L-1细胞悬液,每鼠右前腋皮下接种0.2 ml ，24 h 后将小鼠随机分成生理盐水对照组、CTX组、中药壁虎高（13.5 g/kg）、中(9 g/kg)、低(4.5 g/kg)3个剂量组共5 组,每组各10 只，每日小鼠称重后，阴性对照组根据体重按0.2 ml/10 g用生理盐水灌胃1次，环磷酰胺（CTX）按100 mg/kg第1天腹腔注射1次，壁虎组用0.2%羧甲基纤维素稀释至高（0.675 g/ml）、中(0.45 g/ml)、低(0.225 g/ml)浓度混悬液，按0.2 ml/10 g根据体重每天灌胃一次，共14 d。14 d 后小鼠称重，眼眶取血计数白细胞数，脱臼处死取瘤块称重。

肿瘤抑瘤率= (对照组平均瘤重- 给药组平均瘤重）/ 对照组平均瘤重×100 %［2］

1.2.2 中药壁虎对荷瘤小鼠免疫功能的影响

按上述方法对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察14 d 后，处死动物取胸腺、脾脏称重。胸腺指数=胸腺重/体重，脾脏指数=脾脏重/体重［3］；观察荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响［4］，对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察第14天，用药后2 h每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4 ml，12 h后处死动物消毒腹部，剪开皮肤，经腹腔注入生理盐水2 ml，转动固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴涂于干净载玻片，置于37度的孵箱中温育30 min，以丙酮-甲醇液（1∶1）固

定5 min，再用4%姬姆萨瑞特氏液染色5 min，用蒸馏水漂洗晾干。在油镜下计数200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及每个巨噬细胞中被吞噬的红细胞数，按下公式计算：

吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100 %

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞

1.2.3 小鼠S180肉瘤组织病理学变化肿瘤组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片,常规HE染色,光镜观察肉瘤组织病理变化。

1.2.4 VEGF，bFGF蛋白表达的检测

用SABC免疫组化法，操作步骤按照试剂盒说明书进行。苏木素复染细胞核，将已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，VEGF及bFGF判定与分析：凡细胞浆、细胞膜出现棕黄色颗粒或均质样棕黄色结构者为VEGF或bFGF免疫反应阳性细胞。免疫组化染色评分按Rahman等［5］的方法进行，评分标准是：根据着色细胞的比例（染色范围）及染色强度，染色范围（阳性细胞比率）分为0～4级，阴性为0分；阳性细胞1%～25%为1分；25%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级，阴性为0分；弱阳性为1分；中等强度为2分；强阳性为3分；两者得分相加为最后得分。

1.2.5 细胞凋亡率检测

用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)法检测［6］，小

鼠肉瘤石蜡切片常规脱蜡,操作步骤按照试剂盒说明书进行,苏木素复染细胞核，将已知的阳性切片作阳性对照,以不含末端脱氧核糖核酸转移酶的标记液处理的切片作阴性对照，细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞,随机选10个视野,每个视野观察100个细胞,计数阳性细胞数,计算凋亡指数(apoptoticIndex,AI)AI(%)=阳性细胞计数/观察细胞总数×100%。

1.2.6 统计学方法

实验数据采用±s表示,应用SPASS12.0统计软件进行统计学处理,多组间数据采用方差分析,两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 壁虎对小鼠S180肉瘤的抑制作用

由表1可知壁虎组各组瘤重明显降低，高、中、低组抑瘤率分别为49.8%，52.8%，43.1% ，与阴性对照组相比有显著差异（P0.01），说明壁虎有抗肿瘤活性。从白细胞计数结果显示各用药组白细胞数均有所降低，以环磷酰胺组降低明显（P0.05），壁虎各组也降低，但与对照组比较无明显差异(P0.05)。表1 各组对小鼠S180肉瘤的抑制作用(略)

2.2 壁虎对荷瘤小鼠免疫功能的影响

见表2。可知CTX组与对照组相比，胸腺指数与脾脏指数明显降低（P0.05）,壁虎各剂量组与对照组相比无明显差异。吞噬百分率与吞噬指数方面，CTX组与对照组相比显著降低（P0.01）；壁虎组与对照组相比明显降低（P0.05）。说明中药壁虎没有增强荷瘤小鼠的

免疫功能作用。表2 各组对荷瘤小鼠免疫功能的影响(略)

2.3 小鼠S180肉瘤组织病理学变化

见图1。经HE染色后镜下观察，可见瘤组织呈巢状或片状生长，肿瘤细胞密集排列，细胞大小不同,形态各异；细胞核大小不一，核质比例增大；染色质呈颗粒状，分布不均匀，可见不对称性，多极性核分裂等病理性核分裂象。生理盐水组肿瘤细胞生长旺盛，核固缩较少，片状坏死区面积较小，此外癌巢间微血管丰富。环磷酰胺组有大片的细胞坏死区。壁虎各组均可见不同程度的片状坏死区,瘤组织内及其周围微血管均减少。

2.4 壁虎对小鼠S180组织VEGF，bFGF蛋白表达的影响

见图2～3及表3。VEGF及bFGF免疫阳性细胞在核周胞质(包括核膜)及细胞间质出现特异性片状或颗粒状棕黄色着色, 由表3 免疫组化结果显示：VEGF，bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤组织中呈高表达，环磷酰胺及壁虎各剂量组可降低VEGF，bFGF蛋白表达，与对照组相比有显著差异（P0.05）。

2.5 壁虎对小鼠S180肉瘤细胞凋亡率的影响

见图4及表3。凋亡细胞因其3’-OH断裂的末端可被TUNEL 试剂特异性原位标记，表现为核阳性染色，呈棕黄色，正常细胞不能被标记。结果见表3环磷酰胺治疗组的凋亡率最高，其次为壁虎治疗组,两组的凋亡率与对照组比较差异具有显著性(P0.01)。表3 各组小鼠S180肉瘤组织VEGF，bFGF蛋白表达及肉瘤细胞的凋亡率(略)

3 讨论

壁虎虽未载入《中国药典》，但多年临床实践表明，壁虎的单味药及复方治疗肿瘤均有一定的疗效，尤其对食道癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤的治疗效果明显。壁虎的炮制在《圣惠方》就有：“捣罗为末”。《医学纲目》中有：“烘干”的记载［7］。但现在基本上为生用和制用两种壁虎炮制方法。有关单味壁虎的药理作用研究很少，近几年鲜壁虎的基础研究已有报道［8］，但干壁虎的基础研究未见报道。本实验以干壁虎为研究对象，建立移植性肿瘤动物模型，实验结果表明壁虎有抗肿瘤活性；研究同时我们又对壁虎3 个剂量组的白细胞数、胸腺指数和脾脏指数与对照组进行比较无明显差异，而CTX组与对照组比较下降明显。我们在对小鼠终末与开始的体重进行比较，壁虎各剂量的治疗组与对照组体重均增加，而CTX组体重下降。说明壁虎与CTX比较毒性反应较低。

传统中药抗肿瘤的机制为“扶正祛邪”。“扶正”——增强机体免疫力、“祛邪”——杀伤肿瘤细胞［9］，现认为中药在抗肿瘤方面有多途径，多靶点的特点。本文通过对胸腺指数、脾脏指数、荷瘤小鼠吞噬细胞吞噬指数及吞噬百分率的研究统计表明壁虎不能增强机体的免疫力，说明壁虎的抗肿瘤机制不是通过提高机体免疫力实现的。诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤血管的生成是现在研究抗肿瘤作用最重要的两条途径。在抗肿瘤药物治疗过程中，细胞凋亡是一种重要机制，因为大多数抗肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡来发挥它们的抗肿瘤效应；血管生成与肿瘤发展、转移、预后密切相关，抗肿瘤生成的治疗策略是对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预，因此抗血管生成

现已成为肿瘤治疗的新靶点［9］。VEGF和bFGF是最重要的血管生成刺激因子，其中VEGF是连接新生血管形成各个网络的枢纽，它是目前发现的最为强大、专一的刺激血管内皮细胞增生的因子，VEGF表达增强会诱导产生大量结构和功能异常的血管；bFGF是另一种重要的促血管生长因子，它由肿瘤细胞、巨噬细胞产生由细胞外基质释放,并以旁分泌或自分泌方式发挥作用，它可上调一些重要血管生成促进因子,如VEGF、血纤维蛋白溶酶原激活物等的表达［10］。为了解壁虎抗肿瘤作用的机制，本实验对小鼠肿瘤组织进行细胞凋亡及VEGF、bFGF蛋白的测定，结果表明，壁虎可促进细胞的凋亡，减少VEGF、bFGF蛋白的表达，说明其机制可能与促进凋亡，抗肿瘤血管新生有关。

综上所述，干壁虎有一定的抗肿瘤活性，毒性反应小。抗肿瘤机制可能与促进凋亡，抗肿瘤血管新生有关。

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