细胞凋亡的研究方法的建立与评价
细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展
细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展杨泽栋【摘要】细胞色素C(Cyt C)是呼吸链的电子载体,线粒体释放的Cyt C不仅进入细胞质诱导凋亡,而且也由凋亡细胞释放到细胞外.缺氧、缺血可致心肌细胞线粒体中Cyt C大量释放导致心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡加重时,Cyt C胞质表达增多,抑制心肌细胞凋亡时Cyt C胞质表达也同时减少.血清Cyt C含量的变化可以反映心肌细胞凋亡程度的改变.%Cytochrome C( Cyt C )is the electron carrier of the respiratory chain,Cyt C not only enters cytoplasm to induce apoptosis, but is also released from apoptotic cells extracellularly. Ischemia and hypoxia can cause mitochondrias of myocardial cells to release numerous Cyt C, which induces cell apoptosis. The more cells died, the more Cyt C expressed, when suppressed cell apoptosis, the expressd Cyt C is parallel decreased. The level of Cyt C can reflect the degree of apoptosis of myocardial cell.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(018)003【总页数】4页(P341-344)【关键词】细胞色素C;心肌细胞凋亡;研究进展【作者】杨泽栋【作者单位】内蒙古医学院第三附属医院心内科,内蒙古,包头,014010【正文语种】中文【中图分类】R541.4;R543.3急性心肌梗死是严重危害人类生命健康的常见病，急性心肌梗死后心肌细胞凋亡存在时间长，可引起左心室扩张、心率衰竭等严重不良事件［1］。
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科，而药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。
这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。
1. 细胞存活率测定法细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。
该方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。
常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细胞存活率的。
MTT是一种黄色草酮类化合物，可以被活细胞内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活（如线粒体呼吸链复合物）还原为紫色的结晶物。
通过把MTT溶液添加到细胞培养板中，待细胞生长一段时间后，通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物，最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。
CCK-8（cell counting kit-8）法是一种类似于MTT法的细胞存活率测定方法。
CCK-8是MTT法的改进版，它具有更高的灵敏度和更好的线性关系。
该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物（如细胞色素c）来评估细胞存活率的。
LDH（lactate dehydrogenase）释放法是一种衡量细胞毒性的常用方法。
LDH是存在于细胞质中的酶，只有在细胞膜破裂释放到培养液中时才会被检测到。
通过测量培养液中的LDH含量，可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。
2. 细胞凋亡检测法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，与多种疾病的发生和药物治疗效果密切相关。
因此，在药物筛选与评价中，细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。
常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。
细胞培养过程中常见的变异问题分析与解决方法
细胞培养过程中常见的变异问题分析与解决方法细胞培养作为生物学研究中重要的实验手段之一，被广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和药物研发等领域。
然而，在细胞培养过程中，常常会遇到各种变异问题，如细胞形态改变、生长速度减慢以及细胞死亡等等。
本文旨在分析这些常见的变异问题，并提供相应的解决方法。
一、细胞形态改变细胞形态的改变是细胞培养过程中较为常见的变异问题之一。
通常，细胞形态的异常变化可能包括细胞变大或变小、细胞伸长或收缩等。
这些变异往往会导致细胞功能和代谢活性的改变，从而影响实验结果的准确性。
解决方法：1. 检查培养条件：首先，应对培养基质及培养液的pH值、温度、含氧量等因素进行仔细的调控与监测，以确保细胞处于适宜的生长状态。
2. 检测浓度：根据细胞系的特性，调整培养基中添加物的浓度，如血清、酶消化液等，以维持适当的细胞形态。
3. 鉴别混杂：定期进行细胞株的鉴别，避免因细胞混杂导致形态异常。
二、生长速度减慢细胞在培养过程中，如果出现生长速度减慢的情况，可能会严重影响实验进展与结果的获取。
细胞生长速度的减慢可能是由多种因素引起的，如细胞老化、细胞密度过高、培养液中营养物质不足等。
解决方法：1. 细胞分离：及时将细胞进行适当的分离，避免细胞在培养中过度堆积，从而影响生长速度。
2. 营养补充：调整培养基中的营养物质浓度，确保细胞处于良好的生长环境中，并加强对细胞的营养补充。
3. 细胞凋亡检测：定期检测和评估细胞凋亡的情况，如有需要，可采取相应的干预措施，以保证细胞群体的健康状态。
三、细胞死亡细胞死亡是细胞培养过程中常见的变异问题之一，其发生率可能由多种因素决定，如感染、细胞凋亡、培养条件不良等。
细胞死亡不仅会影响细胞培养的连续性，也会对实验结果的可重复性产生不良影响。
解决方法：1. 检测感染：对培养基进行微生物污染检测，避免细菌、真菌等微生物的感染，导致细胞死亡。
2. 调整培养条件：对培养条件进行优化，如温度、培养基组分等，保证细胞处于最适宜的生长状态。
化妆品中的抗衰老效果评价方法研究
化妆品中的抗衰老效果评价方法研究随着人们对美容和抗衰老的需求不断增加，化妆品市场中涌现出大量标榜抗衰老功效的产品。
然而，如何准确评价化妆品中的抗衰老效果成为一个关键问题。
本文将探讨化妆品中抗衰老效果的评价方法，并提出一种基于细胞与动物实验相结合的综合评估模式。
一、细胞实验评价方法在化妆品研发过程中，细胞实验是最常用的评价方法之一。
通过细胞实验，可以评估化妆品对皮肤细胞的影响，进而判断其抗衰老效果。
常用的细胞实验评价方法包括细胞增殖实验、细胞凋亡实验和细胞酶活性实验。
1. 细胞增殖实验细胞增殖实验可以评估化妆品对细胞增殖的影响，从而判断其是否能促进皮肤细胞的再生和修复能力。
实验中，可以选择常用的细胞系，如人类皮肤成纤维细胞（HDFs）或人类表皮角质形成细胞（HaCaT），将其培养在含有不同浓度化妆品的培养基中，通过细胞计数或细胞活性试剂盒等方法，测定细胞的增殖情况，从而判断化妆品的抗衰老效果。
2. 细胞凋亡实验细胞凋亡是一种正常的细胞自我调节机制，但过度的细胞凋亡会导致皮肤老化。
因此，通过细胞凋亡实验可以评价化妆品对凋亡的影响，判断其是否能有效减缓皮肤衰老进程。
实验中，可以利用流式细胞术或DNA断裂实验等方法，测定细胞凋亡率，进而评估化妆品的抗衰老效果。
3. 细胞酶活性实验细胞酶活性实验用于评估化妆品对细胞内重要酶活性的影响，如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
这些酶在抗氧化过程中起着重要的作用，因此，通过测定酶活性，可以间接评估化妆品的抗衰老能力。
二、动物实验评价方法尽管细胞实验可以提供重要的信息，但动物实验仍然是评估化妆品抗衰老效果的重要手段之一。
动物实验可以更接近真实情况，考虑到整个皮肤系统的复杂性。
常用的动物实验评价方法包括小鼠模型、豚鼠模型和猪模型等。
1. 小鼠模型小鼠是最常用的动物模型之一，可以通过给小鼠灌胃或者外用化妆品等方式，评估其对皮肤的影响，并通过检测皮肤厚度、弹性、含水量、皱纹深度等指标，来评估化妆品的抗衰老效果。
细胞水平评价流程
细胞水平评价流程
细胞水平评价是一种广泛应用于生物医学研究的重要实验方法,用于评估药物、化学物质或其他因素对细胞的影响。
通常包括以下几个步骤:
1. 细胞培养
- 选择合适的细胞系或原代细胞
- 维持细胞在适当的培养条件下生长
2. 细胞处理
- 准备需要评估的药物、化合物或其他处理条件
- 将细胞暴露于不同浓度或时间的处理条件
3. 细胞活性测定
- 使用适当的检测方法评估细胞活性或增殖情况,如MTT、CCK-8、BrdU等
- 收集并分析数据,确定半数有效浓度(EC50)或半数抑制浓度(IC50)
4. 细胞凋亡检测
- 使用流式细胞术、TUNEL等方法检测细胞凋亡水平
- 分析数据,评估处理条件对细胞凋亡的影响
5. 细胞周期分析
- 通过PI或BrdU染色等方法检测细胞周期分布
- 分析数据,确定处理条件是否导致细胞周期阻滞
6. 其他细胞功能分析
- 根据需要进行细胞迁移、侵袭、分化等功能评估
- 采用划痕实验、Transwell小室、免疫荧光染色等方法
7. 数据分析与解释
- 使用适当的统计方法分析实验数据
- 绘制曲线图、柱状图等,直观展示结果
- 解释结果,评估处理条件对细胞的影响
细胞水平评价为研究药物、化合物或其他因素的生物学效应提供了有力支持,结果能够反映细胞增殖、存活、凋亡、周期及其他功能方面的变化,为进一步的动物实验和临床试验提供重要依据。
细胞凋亡的研究方法
一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、 ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法）， Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测， AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等。
不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。
三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法 (HE 染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳 ) 。
四、细胞凋亡检测1、早期检测 :1)PS(磷脂酰丝氨酸 ) 在细胞外膜上的检测2)细胞内氧化还原状态改变的检测3)细胞色素 C 的定位检测4)线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。
对于晚期检测通常有以下方法：1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 )2)LM-PCRLadder ( 连接介导的 PCR检测 )3)Telemerase Detection ( 端粒酶检测 )3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3） TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过 DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为 dUTP）间接或直接接到DNA片段的 3’ -OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、 LM-PCRLadder ( 连接介导的PCR检测 )当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA的变化。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
细胞凋亡和生长因子的调控和机制研究
细胞凋亡和生长因子的调控和机制研究随着现代医学技术的不断发展，人类对于一些疾病的治疗方法也越来越高效和精准。
而细胞凋亡和生长因子作为目前最为热门的研究领域之一，其调控和机制研究将会为人类的健康事业带来巨大的进步。
一、细胞凋亡的调控机制细胞凋亡，也称细胞自杀，是一种自然而然的程序性细胞死亡现象，是较为重要的重大生物学过程之一。
细胞凋亡的调控机制目前还在不断研究中，主要包括外源性、内源性以及程序本身这三个方面。
外源性调控机制主要是指通过一些外在因素来刺激细胞产生凋亡反应。
常见的刺激因素包括放射线、毒素、化学药物、热休克等。
通过这些因素对细胞的刺激，能够引起细胞凋亡的发生。
内源性调控机制则是指细胞在自身内部某些因素的作用下，产生了凋亡反应。
这些因素包括病毒感染、细胞DNA损伤、细胞膜受损以及无法修复的细胞器损伤等，这些因素产生的累积效应会导致细胞凋亡的发生。
细胞程序本身，也就是指细胞凋亡过程中，必然存在某些分子程序在调控着细胞凋亡的进行。
例如细胞凋亡中的caspase家族以及凋亡信号转导途径等，这些程序的存在是细胞凋亡能够进行的重要保证。
二、生长因子的调控机制生长因子是一类由细胞自身产生并在体内参与调控和维持体内各种功能的蛋白质分子。
在生物体内，生长因子不仅能够调控细胞的生存、增殖、分化、分裂等功能，而且在某些情况下还能够刺激细胞分泌其它物质，从而影响整个生物个体的生理与形态发育。
生长因子的调控机制包括内源性调控和外源性调控。
内源性调控是指生长因子产生于细胞内部，并在细胞内部对细胞本身进行自身的调控。
例如内源性生长因子家族分化因子（diffrention factors）、转录因子（transcription factors）等，这些因子促进细胞的生长、分化等功能。
外源性调控是指环境因素刺激生长因子产生，从而调节细胞的生长。
例如外源性生长因子家族胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等，这些生长因子在外部环境中刺激下，能够促进细胞生长、增殖等。
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• 凋亡：细胞凋亡指的细胞的程序性死亡，细胞被 自身的酶降解，按一定的步骤“自杀”，其死亡 细胞仍为一整体，最终被白细胞吞噬。（而细胞坏死会
有细胞壁破裂的现象，内含物外泄，会影响周围的细胞。）
启动 信 号 通 路
凋亡早期
凋亡中期
凋亡晚期
Caspase 激活
★核染色质凝缩 凋亡小体形成 ★ 细胞膜PS 外翻 ★线粒体膜电位丧失 ★DNA 被切割成片段
进行有丝分裂的细胞才具有细胞周期。 ）
• 分化：在个体发育中，通过细胞分裂后产生的子 代细胞比上一代细胞具有更专一的功能。后代在 形态结构和功能上发生稳定性的差异过程称为细 胞分化（cellular differentiation）。（比如血液中的红细胞、
白细胞、淋巴细胞、血小板等都是从造血干细胞分化出来的，但是与造血干细胞相比， 这些子代细胞都具有更加专一的功能。 ）
Gossypol（24h）
个化 靶向治疗
Deficiency
• Chinese herbal medicine in Chaoshan area
• HL60(Human promyelocytic leukemia cells) • derived from a 36-year-old woman with acute promyelocytic leukemia at the National Cancer Institute
研究方法建立与评价
• MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色 法）是Mosmann1983年报告的。原理是活 细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物 （MTT）由黄色还原为紫红（兰）色的甲 （肷）紫,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚 枫、酸化异丙醇等）,甲紫（肷）产量与细 胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测 定其OD值。
形态学观察
DNA 被切割成片段
细胞膜PS 外翻
Annexin V
• 基本原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些 细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细 胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正 常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂 分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的 血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高 度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表 面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏 死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好 的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以 建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种 染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
• 灵敏度 • 特异性 • • • • • 蛋白质分析 1，染色 2，酶 3，免疫 分泌蛋白、膜蛋白、细胞质，细胞核蛋白
方法学建立与研究策略
• 药物浓度的选择（MTT）
• 形态学观察（凋亡小体形成） • DNA 被切割成片段 • 细胞膜PS 外翻 • Caspase 激活 • 信号通路
MTT测定细胞增殖
研究背景
肿瘤治疗
• • • • 手术 放疗 化疗 骨髓移植（白血病）
立题依据
增殖
Survival Growth
分化
Differetiation
凋亡
Apoptosis
肿瘤 Tumour
• 增殖：细胞通过分裂使细胞数目增加的过程 ，细 胞分裂。（真核细胞的增殖方式有：有丝分裂、减数分裂、无丝分裂三种方式，只有连续
研究模型
• 慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML ） • 逆转 • K562 cell line 分化（红系细胞） • 增殖 • • 凋亡 药物诱导
• K562 cells
• a bcr:abl positive erythroleukamia line derived from a 53 year old female CML patient in blast crisis • Philadelphia chromosome
Apoptosis 细胞凋亡研究方法建立与评价
蒋纪恺
•
研究生？
• 研究方向 • 研究立题（研究背景、发现问题、提出问 题（？）、提出假设、解决问题的策略与 方法） 申请课题，获得经费 • 实验验证（实验模型、技术指标、方法建 立与评价） • 结果分析（撰写论文，申报专利，评奖）
• 研究方向：白血病 • 研究立题：肿瘤靶向治疗的分子机制研究。文献 • 阅读与学习。信号转导在白血病发生 • 与治疗的背景知识 • • 研究模型：白血病细胞株；动物模型等 • 技术平台：实验技术的建立与评价，（技术指 • 标，动手能力） • • 结果分析：统计学知识，文献回顾 • 论文撰写：语言能力