核酸分子杂讲义交技术
核酸分子杂交课件
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类（可编辑）
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类分子杂交技术与应用分子杂交技术与应用? 分子杂交技术的目的是什么?分子杂交的基本方法有哪些?Southern印迹法有哪些步骤,为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢?一、核酸分子杂交的基本原理与分类一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)1、变性(denaturation)(1)定义:(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
(2).引起核酸变性的因素(2).引起核酸变性的因素变性剂变性剂酸(尿素)(尿素)碱碱有机溶剂热有机溶剂热(乙醇)(乙醇)(3)、变性后核酸的特点:(3)、变性后核酸的特点:粘度下降粘度下降密度增加密度增加紫外吸收增加紫外吸收增加 2、融解温度(Tm):2、融解温度(Tm):定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最260260 大值一半时的温度。
大值一半时的温度。
3、复性(退火)3、复性(退火) 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
变性DNA 经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
影响复性速度的因素: 影响复性速度的因素:DNA浓度 DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 DNA片段复杂性合适的复性温度合适的复性温度适当的离子强度适当的离子强度4、杂交4、杂交定义两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即分子杂交。
分子杂交。
DNA/DNA的杂交作用:DNA/DNA的杂交作用: 检测特定生物有机体之间的亲源关系检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA:DND/DNA或RNA/DNA: 揭示核酸片断中某种特定基因的位置。
第八章 核酸分子杂交技术
第八章核酸分子杂交技术主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。
第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述•1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；•60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础；•70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富；•80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；•90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。
核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键；二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键；高级结构：染色体二、核酸变性核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。
•化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。
•化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。
DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。
如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等)变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。
②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。
③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。
核酸分子杂交技术
K去除核酸表面的蛋白质
• 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
或硝酸纤维素膜上。
5、Southern杂交 （ 1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位 预杂交液 为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA双 链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
6、杂交结果检测
（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
mRNA
逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
4章 核酸分子杂交技术
用探针检测与靶DNA 用探针检测与靶
• 一、核酸探针的种类 • 根据其性质、检测目的不同可以分为 种： 根据其性质、检测目的不同可以分为4种 • DNA探针、RNA探针、 探针、 探针、 探针 探针 • cDNA探针、寡核苷酸探针 探针、 探针 • 二、探针的标记 • （一）标记物 • 1、核素标记物。如：32P，3H，35S 等。 、核素标记物。 ， ， • 2、非核素标记物。如：生物素、地高辛、荧光素 、非核素标记物。 生物素、地高辛、 等
1 2
支持物
NC或尼龙膜 或尼龙膜
杂交显色， 杂交显色，与探针同 源的DNA DNA片段 源的DNA片段
DNA印迹 印迹
• Northern 印迹杂交： 印迹杂交：
• 检测 检测RNA（主要是mRNA） （主要是 ） • 与Southern杂交的不同点： 杂交的不同点： 杂交的不同点 • 靶核酸： 靶核酸：RNA；转膜：不需变性 ；转膜：
• 核酸分子杂交的 种形式 核酸分子杂交的3种形式 • DNA-DNA之间； 之间； 之间 • RNA-RNA之间； 之间； 之间 • DNA-RNA之间。 之间。 之间 • 核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应 用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异DNA 用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异DNA RNA序列片段的有力工具 或RNA序列片段的有力工具
DNA 样品
点样
Probe-32P
检测 应用： 应用： 混合样品DNA DNA鉴定 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析
A B 1 2 3 4
原位杂交(in 原位杂交 situ hybridization)
• 将标记的核酸探针直接与 或T中的核酸进行杂交， 将标记的核酸探针直接与C或 中的核酸进行杂交 中的核酸进行杂交， 称为原位杂交。 称为原位杂交。 • 现常与 现常与PCR结合以提高灵敏度，叫原位ＰＣＲ 结合以提高灵敏度， 原位ＰＣＲ 结合以提高灵敏度 • 特点： 特点： – 能在成分复杂的 中进行单一 的研究； 能在成分复杂的T中进行单一 的研究； 中进行单一C的研究 – 不需从T或C中提取核酸； 不需从 或 中提取核酸； 中提取核酸 • 方法： 方法： • C或组织的固定：载玻片 或组织的固定： • 组织C杂交前的预处理 组织C
第4讲 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术：
具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在 适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互 补配对原则特异性地复性，形成双链
探针(序列已知，单链)
待测核苷酸序列(单链)
主要内容
第一节 分子杂交技术的理论基础 第二节 核酸分子杂交的方法 第三节 核酸杂交的探针
Tm不是一个固定的数值， 它与很多因素有关： pH值、离子强度和DNA 的碱基比例
DNA制剂不应保存在 离子强度过低的溶液中， 一般保存在1mol/l NaCl溶液中较稳定
（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按
碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性 或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷 酸/DNA 和 寡核苷酸/RNA。
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的 氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2、变性的方法： 1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸
分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移 到固相支持物上
31、同 转时移带缓动冲凝液胶中中含的有高 D浓N度A的片N段a垂Cl直和向柠上檬运酸动钠， 凝胶中的DNA片段移出 凝 2、胶上而层滞吸留水在纸膜的上虹吸作用 使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、 凝胶、硝酸纤维素滤膜
向上运动
3）真空转移法
原理与毛细管虹吸法相同
不同点：滤膜在下，凝胶在上的方式
《核酸杂交技术》PPT课件
二、核酸杂交的概念 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)是指具有互补序列的两 条核酸单链在一定条件下按碱基配对原 则形成双链的过程。 通过将标记的已知核酸片段作为探针， 与待测标本核酸进行杂交反应，即可观 察到样本核酸中相应的基因。
①
②
③ ④
根据检测对象和手段不同可将杂交枝术分 为不同类型，常见的有四种类型 Southern印迹杂交（DNA印迹杂交） Northern印迹杂交（RNA印迹杂交） 原位杂交技术（in situ hybridization） 斑点及狭缝杂交(dot blot hybridization) 根据杂交体系的不同，核酸杂交可以分为 液相杂交和固相杂交。
3．电转移法
是通过电泳使凝胶中的带电荷样品沿着与凝胶平 面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，结合到固相 膜上，是一种简便、快速、高效的转移方法。 核酸电转移法一般选用尼龙膜而不是硝酸纤维素 膜作为固相膜
第四节 核酸分子杂交技术
一、 Southern印迹杂交（Southern blotting)
随机引物法（random priming)
Klennow片段 3'ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA5' 5'TAGCA3'
假设：dGTP用32P
①将探针模板变性，与随机引物退火； ②加Klenow 片段，以一种标记dNTP 和三 种普通dNTP 为底物，合成标记DNA； ③变性解链，得到标记DNA 探针
固相杂交是将待测核酸先固定在固相支持物上， 然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交 体结合在固相支持物上。
第二节 核酸探针与标记