最新致泻大肠埃希式菌的检验
致泻大肠埃希氏菌
3.
生化反应
生化反应十分活泼，是鉴定肠道菌的重要 依据。 乳糖发酵试验在初步鉴别肠道致病和非致 病菌时有重要意义，肠道致病一般不分解乳 糖，而非致病菌多数能分解乳糖。
鉴定中最重要的生化反应
乳糖发酵试验
肠道非致病菌（埃希菌属） 发酵乳糖、产酸产气＋
肠道致病菌（志贺菌属、
沙门菌属等）不发酵乳糖 —
4. 抗原构造复杂
在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑浊，而 后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。
培养特性
部分菌落可出现β溶血。 在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落。
在SS琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌
也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落。
在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落。
在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色。
肠产毒性大肠埃希氏菌 （Enterotoxigenic E. coli,ETEC）
引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻， 也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性， 一般2-3天即愈。致病因素是LT或ST，或两者 同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者 为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ETEC 主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参 考意义。
分类
肠杆菌科
埃希氏菌属
大肠埃希氏菌
致泻大肠埃希氏菌
肠道致病性大 肠埃希氏菌 EPEC
肠道出血性大 肠埃希氏菌 EHEC
产肠毒素大肠 埃希氏菌 ETEC
肠道侵袭性大 肠埃希氏菌 EIEC
致泻大肠埃希氏菌
致泻性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化 特性均与非致病的大肠埃希氏菌非常相似，以至难 以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差 异来区别。 在致泻性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人 的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感 染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害 畜牧业，降低畜产食品的质量。致泻性大肠埃希氏 菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其 人畜粪便污染的各种食品中分离出来。
致泻性大肠杆菌检验技术
• 涂布平板 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取 50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改 良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂 布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划 线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收 后，翻转平板，于36±1℃培养18～24h。注意，若 CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂 平板表面水分过多时，应在37℃下干燥10～20min， 涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。
• 洗涤：从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中 加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上， 洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.4～2.6。
• 重复上述步骤2.4～2.5
注意: 洗涤共3次，动作要轻柔。
吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速 度。上清液的吸取应尽量完全。 使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应 远离放置。
如非左述的反应结果 非大肠埃希氏菌
报告
直接分离培养
• 新鲜粪便标本接种下列培养基 ➢ 麦康凯（Mac）或伊红-美蓝等弱选择性鉴别培养
基。 ➢ 山梨醇-麦康凯琼脂或O157显色培养基，肠出血性
大肠杆菌及某些致病性大肠杆菌不发酵或迟缓发 酵山梨醇，菌落为无色。 ➢ 血琼脂平板，用于观察肠致病性大肠杆菌的溶血 及其他菌落的鉴别，37℃培养18-24h观察结果。
致病物质与所致疾病
• 在肠道内一般不致病，但如果移位侵入肠 道外的组织或器官可引起肠外感染，以化 脓性炎症最为多见。
•
引起泌尿系统感染的大肠杆菌称为泌尿道 致病性大肠杆菌（UPEC），引起尿道炎、
志贺氏菌和致泻大肠埃希式菌的检验
葡萄糖半固体原理及结果。 三糖铁（TSI）琼脂试验的原理
2－志贺氏菌 3－沙门氏菌
4－大肠杆菌 Organism Test Result
1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假 单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
2、分离培养 • 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌 液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； • 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 • 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红 美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→ 肠毒素鉴定→报告
1、增菌培养 • 以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营 养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加 灭菌砂磨碎。 • 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。 • 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
量及剩余体质量,二者之比大于0.09阳性,0.070.09为可疑.
6、结果报告 • 根据以上生化试验、血清学试验和肠毒素试验结 果作出报告。 • 如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结 果； • 如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验 结果。
2、分离培养 • 强选择性平板：SS或HE • 弱选择性平板：麦康凯或无色透明，中等大小，光滑圆形菌 落
基于多重PCR_检测食品中致泻大肠埃希氏菌
分析检测基于多重PCR检测食品中致泻大肠埃希氏菌谭 波，黄坤宁*（贵州省检测技术研究应用中心，贵州贵阳 550014）摘 要：目的：提高实验室对食品中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）的检测能力与检测效率，验证DEC多重PCR试剂盒的适用性。
方法：依据《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》（GB 4789.6—2016）分离鉴定样品23-H770、23-X371，用DEC多重PCR检测试剂盒检测5种DEC的12条特征基因。
结果：23-H770未检出DEC，23-X371检出STEC/EHEC，阴、阳性对照菌种均检出GB 4789.6—2016中5种DEC目标条带与型别对照表相应基因条带，且空白对照12条目标基因条带均未检出。
结论：能力验证样品评价结果为“满意”，多重PCR检测试剂盒能快速准确检测EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC和EAEC。
关键词：多重PCR；致泻大肠埃希氏菌；电泳；检测Detection of Diarrheogenic Escherichia coli in Food Based onMultiplex PCRTAN Bo, HUANG Kunning*(Guizhou Testing Technology Research and Application Center, Guiyang 550014, China) Abstract: Objective: To improve the detection capability and efficiency of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) in food, and to verify the applicability of DEC multiplex PCR kit. Method: Samples 23-H770 and 23-X371 were isolated and identified according to GB 4789.6—2016, and 12 characteristic genes of 5 species of DEC were detected with DEC multiple PCR detection kit. Result: DEC was not detected in 23-H770, STEC/EHEC was detected in 23-X371, and GB 4789.6—2016 were detected in all the five DEC target bands and corresponding gene bands in the genotype comparison table, while none of the 12 target gene bands were detected in the blank control. Conclusion: The evaluation result of ability verification sample is satisfactory. The multiplex PCR kit can detect EPEC, EIEC, ETEC, STEC/EHEC and EAEC quickly and accurately.Keywords: multiplex PCR; diarrheagenic Escherichia coli; electrophoresis; detection致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）是一类可引起人体腹泻症状的大肠埃希氏菌（Escherichia coli），常见的DEC主要有5种[1-2]。
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程1. 概述致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。
与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。
2. 标本类型粪便标本。
3. 鉴定3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。
3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。
3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。
3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。
IMViC++--，3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。
3.6 操作步骤3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。
3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。
肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。
ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。
肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。
肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。
4. 药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。
5. 质量控制参见质量管理程序。
6. 检验结果解释与分析疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。
大肠埃希氏菌实验室检验方法
大肠埃希氏菌实验室检验方法简介大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它可以引起多种疾病，包括食物中毒、泌尿道感染和肠道感染等。
因此，对大肠埃希氏菌进行实验室检验是非常重要的。
本文将介绍大肠埃希氏菌实验室检验的方法和步骤。
实验室检验方法大肠埃希氏菌实验室检验主要包括以下几个方面：1.样品采集：根据不同的检验要求，可以采集不同的样品，例如食物、水样、粪便等。
采集样品时需要注意避免污染和交叉感染。
2.样品处理：对于食物和水样，通常需要进行前处理步骤，如浸泡、稀释等。
对于粪便样品，可以直接进行处理。
3.培养方法：将样品接种到适当的培养基上，培养培养基通常包括富营养的琼脂、选择性培养基等。
大肠埃希氏菌喜欢在富含葡萄糖的培养基上生长。
4.鉴定方法：通过观察菌落形态、生理生化特性和抗生素敏感性等指标，进行大肠埃希氏菌的鉴定。
常用的鉴定方法包括免疫学方法、分子生物学方法和生化试剂盒等。
5.结果判读：根据鉴定结果，判断样品中是否存在大肠埃希氏菌。
根据不同的检验要求，可以进行定性或定量判读。
实验步骤下面是一个常见的大肠埃希氏菌实验室检验的步骤示例：1.样品采集：根据检验要求，采集相应的样品。
例如，如果是食物样品，可以使用无菌取样棒在食物表面轻轻刮取一些，然后放入无菌容器中。
2.样品处理：对于食物样品，可以将其浸泡在含有缓冲液的容器中，摇动一段时间，使菌落充分分散。
对于水样，可以进行适当的稀释。
3.培养方法：将处理后的样品接种到富含葡萄糖的培养基上，如MacConkey琼脂或EC琼脂。
根据需要，可以使用选择性培养基，如Eosin MethyleneBlue琼脂。
4.培养条件：将接种的培养基置于适当的温度和湿度条件下，一般为37摄氏度，培养时间通常为24小时。
5.菌落观察：观察培养基上的菌落形态，大肠埃希氏菌通常呈现为粉红色的菌落，具有金属光泽。
6.鉴定方法：根据需要，可以进行进一步的鉴定。
致泻大肠埃希氏菌检验标准
致泻大肠埃希氏菌检验标准
1. 范围
本标准规定了致泻大肠埃希氏菌检验的术语和定义、通用要求、样品采集与处理、实验室基本要求、检验程序、结果报告、记录和档案管理等要求。
本标准适用于食品、水源等样品的致泻大肠埃希氏菌检验。
2. 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
GB 4789.16 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
3. 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 致泻大肠埃希氏菌Escherichia coli causing diarrhea
能够引起人类腹泻症状的大肠埃希氏菌。
4. 通用要求
4.1 实验室应建立完善的生物安全制度，保证工作人员的安全和防护。
4.2 实验室应配备相应的仪器设备和试剂，保证检验的准确性和可靠性。
4.3 实验室应按照相关规定做好废弃物的处理和消毒工作，防止污染环境和危害人员健康。
5. 样品采集与处理
5.1 样品采集
5.1.1 食品样品：采集具有代表性的食品样品，包括原材料、半成品、成品等。
5.1.2 水源样品：采集具有代表性的水源样品，包括自来水、饮用水、地表水等。
5.2 样品处理
5.2.1 食品样品：将样品无菌包装或以其他方式保证无菌操作，避免交叉污染。
致病性大肠埃希氏菌及其检验
5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见β溶血环。 6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落 7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌， 也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落； 8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌 落 9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色 •
埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落
• 在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃 希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基 是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指 示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变 红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
大肠杆菌革兰氏染色照片
致病性大肠埃希氏菌的检验
（四）血清学试验 • 假定试验： 从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病 性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒 素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌 O157血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做 阴性报告。当与某一种多价O血清凝集时,再与该 多价血清所包含的单价血清做实验,如与某一种单 价O血清呈现强烈的凝集反应,即为假定实验阳性. 不凝集的培养物可做阴性报告。
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（2）所致疾病 • 肠外感染：泌尿系统感染最常见病原菌。还可引 起胆囊炎、肺炎、新生儿或婴儿脑膜炎。 • 腹泻：产毒素大肠杆菌是婴儿及旅游者腹泻的主 要原因；致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要原因； 侵袭型大肠杆菌主要引起较大儿童和成年人腹泻。
一、埃希氏菌属生物学特性
C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
• 利用枸橼酸盐生长 + • 不能利用 •
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五物 、学 微检 生验
检样
乳糖发酵阳性 的发酵管
25g+营养肉汤225mL
36℃±1℃
6h
麦康凯 EMB
36℃±1℃ 18h~24h
肠道菌增菌肉汤
乳糖发酵或不发酵的菌落3个~5个， 氧化酶—，革兰氏阴性杆菌
TSI、靛基质、pH7.2尿素 KCN、赖氨酸、动力
TSI底层+， H2S—，
致泻大肠埃希式菌的检验
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli 扫描照片
致泻大肠埃希式菌的检验
三、污染途径 ❖ 污染水源和土壤，进而污染食物 ❖ 肉类食品 ❖ 乳制品 ❖ 水产品等
致泻大肠埃希式菌的检验
四、致病性
❖ 肠道内感染 腹泻、食物中毒、肠热症
❖ 肠道外感染 鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、 肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
❖ 当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清 所包含的单价O血清做试验。
❖ 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一 单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。
致泻大肠埃希式菌的检验
多价血清 单价血清单价血清单价血清单价血清
OK多价1 O55：K59（B5） O86：K61（B7） O111：K58（B4） O127a：K63（B8）
大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分 解乳糖，不产生H2S。
致泻大肠埃希式菌的检验
靛基质试验：细菌分解蛋白质中的色氨酸产
生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成 玫瑰吲哚而成红致色泻大。肠埃希式菌的检验
❖ 脲酶试验：细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基 pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲 酶。
❖ TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,KCN 阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌.
❖ TSI底层不产酸或 H2S、KCN、尿素有任何一项 为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。
❖ 必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
致泻大肠埃希式菌的检验
❖ 三糖铁琼脂试验：只能利用葡萄糖的细菌， 葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因 量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化， 加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱 性产物，故使斜面后来又变红，底部由于 是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍 保持黄色。而发酵乳糖的细菌，则产生大 量的酸，使整个培养基呈现黄色。细菌分 解含硫氨基酸，产生H2S，与FeSO4发生反 应形成FeS。
致泻大肠埃希氏菌及其检验
致泻大肠埃希式菌的检验
一、目的与要求
❖ 1、学习掌握致泻性大肠埃希氏菌检验的基本原理 和方法；
❖ 2、了解动物性食品检验致泻性大肠埃希氏菌的意 义。
致泻大肠埃希式菌的检验
二、 生物学特性
俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周生鞭
毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
致泻大肠埃希式菌的检验
EMB培养基
菌落特征：黑紫色或紫红 色，圆形，边 缘整齐，表面 光滑，湿润， 常具有金属光 泽，也有的呈 紫黑色，不带 或略带金属光 泽。
致泻大肠埃希式菌的检验
3、生化检验
❖ 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁 琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这 些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿 素琼脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。 以上培养物均在 36℃培养过夜。
报告。
致泻大肠埃希式菌的检验
KCN—，尿素—
血清学试验
致泻大肠埃希式菌的检验
报告
非左述的各种 反应结果
非大肠埃希氏菌
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红
美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→报告
致泻大肠埃希式菌的检验
1、增菌培养 ❖ 以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营养 肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加灭 菌砂磨碎。
❖ 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。
❖ 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
致泻大肠埃希式菌的检验
2、分离培养 ❖ 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌
液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； ❖ 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 ❖ 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
❖ 动力试验：有动力的细菌会沿着穿刺线扩散生长。 ❖ 赖氨酸脱羧试验：细菌从赖氨酸脱去羧基（-
COOH），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚 蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性，如果细菌不能 脱酸，培养基不变则为黄色。
致泻大肠埃希式菌的检验
4、血清学试验
❖ 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的 琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大 肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清 和出血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试 验。
OK多价2 O26：K60（B6） O125：K70（B15） O126：K71（B16） O128：K67（B12） OK多价3 O44：K74（L） O114：K90（B） O119：K69（B14） O142：K86（B）
致泻大肠埃希式菌的检验
5、结果报告 ❖ 根据以上生化试验和血清学试验结果作出