单链抗体表达研究进展

单链抗体（single-chain antibody fragment，scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过１５～２０个氨基酸的短肽（linker）连接而成。

在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。

Kanter等［１］研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白，是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗。

Wang等［２］通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和抗单端孢霉毒素（ZEN）scFv基因融合，表达为抗DON和抗ZEN scFv，结果显示双功能抗体成功构建，并可应用于DON和ZEN检测。

scFv表达是scFv制备的关键步骤。

将基因通过表达载体整合入受体宿主基因内，依靠宿主的转录和翻译系统，scFv 片断完整表达于产物中。

本文将就scFv 表达技术及其进展做一综述。

１表达载体常用的scFv表达载体包括：质粒载体、噬菌体载体、腺病毒载体等。

１．１质粒载体质粒（plasmid）是以超螺旋状态存在于细菌细胞质中的一种能够自主复制的遗传成分，多以共价闭合环状的DNA（covalently closed circular DNA）分子形式存在［３］。

质粒载体借助于物理或化学的作用导入细胞内，依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力分为整合型和附加体型两种。

Jurado等［４］以Sigma-５４依赖的分解性TOL质粒为表达载体，在M１３噬菌体文库中表达的scFV 含量增高且与受体结合活性增强。

１．２噬菌体载体噬菌体表面呈现展示技术（phage display techniques），是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术。

它以改建的噬菌体为载体，将编码外源肽或抗体可变区的DNA片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，然后进行DNA序列测定。

它将基因型、表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选系统［５］。

目前常用的噬菌体载体为pComb３及Pcantablf，组成噬菌体抗体（phageantibody）库，库中每一个噬菌体在其表面可表达一种特异性抗体（Fab或scFv）。

由于噬菌体抗体既可以识别相应抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行扩增，重复“吸附－洗脱－扩增”过程，可筛选容量为１０８以上的噬菌体抗体库。

Lee等［６］利用噬菌体表面呈现技术和抗体库技术，将SARS-CoV蛋白免疫小鸡后，提取脾B淋巴细胞５×１０７个克隆，数轮Panning淘筛、洗脱、富集后，抗体数量增加１０倍，发现独特scFv表达噬菌体和噬菌体表面呈现系统结合可以提高scFv的产量和亲和力。

Hamasaki等［７］报道了一种新改进的免疫胶体分子筛技术（immunogel-biopanning）。

新改进immunogel-biopanning技术有两个特征：（１）在蛋白电泳后进行胶体切片，使用immunoplatescoate将不同片断带的蛋白洗提；（２）通过使用噬菌体克隆作为探针，产物对目标分子的敏感性的检测经生物学放大可以极大提高。

Auf der Maur等［８］报道了一种新型胞内的抗体文库筛选系统，这些经选择后的scFv能够在还原环境下保持稳定，并且无论在细胞内还原环境还是细胞外的正常环境下都表现出较高的生化稳定性、可溶性、抗原识别能力。

Emadi等［９］将噬菌体表面呈现展示技术和原子动力显微镜（atomic forcemicroscopy）生物筛选技术结合成一种新的生物淘筛技术，仅使用最小量的目标抗原，就能够筛选特异性结合α－synuclein的scFv。

１．３腺病毒载体腺病毒由于其基因结构、功能清楚，易于制备、纯化、浓缩，宿主范围广、感染率高、理化性质稳定、不整合宿主基因组、遗传毒性和免疫毒性低的特点。

Ad２和Ad５是目前应用最广的两种腺病毒血清型。

Hedley等［１０］将腺病毒和５６６FF-scFv重组，并转染２９３T／１７CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞），发现５６６FF-scFv准确转染入CHO细胞并且获稳定表达。

２表达载体受体scFv的表达载体受体多种多样，有细菌、真菌、动物细胞（COS细胞、CHO细胞、昆虫细胞）、植物细胞等。

最常用的表达受体为大肠杆菌（E．coli），大肠杆菌作为表达受体表达具有生长快速、易于操作、转化和转导效率高，可在短时间内大规模地生产抗体蛋白，便于纯化、分析和应用。

然而，大肠杆菌不能对重组抗体进行翻译后的糖基化、磷酸化修饰，不能完成多聚体的组成和二硫键的形成。

在植物中表达的scFv通常称为植物抗体（plantibody）。

Brereton等［１１］通过基因枪轰击转基因商业小麦Westonia，Westonia能表达大鼠胸腺表面CD４和CD２８两种scFv，成熟的种子保存１年后scFv仍保持较高活性，转基因种子提取的scFv具有内毒素污染小、易于纯化和收集。

Putalun等［１２］针对药用植物喀西中的药理活性成分澳州茄碱糖苷（solasodine glycosides）制备了单克隆抗体，通过载体转化发根农杆菌插入Ri质粒T-DNA中感染喀西茄植株，诱导scFv在毛状根表达。

３基因转染技术基因转染技术主要有磷酸钙共沉淀技术、电穿孔方法、脂质体法。

３．１磷酸钙共沉淀技术将氯化钙、RNA（或DNA）和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。

磷酸钙－DNA复合物黏附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。

沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成Kaya R A，Aydin Y．Modified transpedicular approach for the surgical treatment of severe thoracolumbar or lumbar burst fractures［J］．Spine，２００４，４（２）：２０８－２１７．Maciejczak A，Barnas P，Dudziak P，etal．Posterior keyhole corpectomy withpercutaneous pedicle screw stabilization inthe surgical management of lumbar burstfractures［J］．Neurosurgery，２００７，６０（４Suppl２）：２３２－２４１；discussion２４１－２４２．（收稿：２００８－０７－０８编辑：徐荣远）［２２］［２３］单链抗体表达研究进展邓亮综述舒建昌审校作者单位：５１０２２０广州市红十字会医院消化内科功至关重要。

针对磷酸钙共沉淀法低产量、低转染效率的特点，Olton等［１３］报道了单分布CaP-Pdna粒子合并优化Ca／P 比率的方法来提高效率，当Ca／P比率介于１００～３００时可达最大的转染效率。

３．２电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中，细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔，外源性DNA可通过穿孔处进入细胞内［１４］。

电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

Bejjani等［１５］研究发现短暂而高强度的电流脉冲能获得更高的寡核苷酸序列和质粒的转化效率，这种方法能安全有效地在体外进行目标基因转化，而离子渗透法则只对分子量小的核酸片段（如SiRNA）有转化作用。

３．３脂质体法脂质体介导的细胞转染主要是通过脂质体DNA复合物与细胞融合而将DNA导入细胞，使用该方法达到的转染效率较高，但只能转染分子量大的抗体，适用性不广。

钱锋等［１６］研究发现脂质体DNA复合物对细胞有毒性，随着DNA量增加以及DNA－脂质体复合物作用时间延长，细胞毒性逐渐加重，细胞存活率下降，转染效率降低。

４表达形式scFv在大肠杆菌中的表达形式主要有融合表达、胞内表达、分泌表达三种。

分泌表达是常用的表达方式，在信号肽Mel、Om-pA、PelB、PheA的引导下，scFv 被分泌至大肠杆菌外周质或培养液中，并完成二硫键的形成和肽链折叠，成为有活性的可溶性表达产物。

Strube等［１７］通过将scFv和Fc片段融合，构建了scFv-Fc融合胞内小体，发现可以降低细胞内表达scFv蛋白的不稳定性，而维持亲和力不变。

无论是融合表达、胞内表达、分泌表达，还是降低培养温度、改变诱导物IPTG的浓度，表达产物都是以包涵体形式存在。

包涵体需要经过溶解、变性、复性，最终才能获取有活性的scFv蛋白，包涵体溶解的方法主要有超声破碎和酶溶［１８］。

５结语scFv技术经过了２０多年的发展，取得了巨大的成就，已经有抗体开始进入临床试验阶段［１９－２０］，并取得积极的疗效。

随着分子生物学技术的深入发展，scFv技术必将在肿瘤、免疫性疾病等方面发挥其独特的作用，促进医学事业的全面发展。

６参考文献Kanter G，Yang J，Voloshin A，et al．Cell-free production of scFv fusionproteins：an efficient approach forpersonalized lymphoma vaccines［J］．Blood，２００７，１０９（８）：３３９３－３３９９．Wang S，Zheng C，Liu Y，et al．Construction of multiform ScFv antibodiesusing linker peptide［J］．J GenetGenomics，２００８，３５（５）：３１３－３１６．Holmes D S，Quigley M．A rapid boilingmethod for the preparation of bacterialplasmids［J］．Anal Biochem，２００５，１１４（１）：１９３－１９７．Jurado P，Fernandez L A，de Lorenzo V．In vivo drafting of single-chain antibodiesfor regulatory duty on the sigma５４-promoter Pu of the TOL plasmid［J］．MolMircobiol，２００６，６０（５）：１２１８－１２２７．Holliger P，Hudson P J．Engineeredantibody fragments and the rise of singledomains［J］．Nat Biotechnol，２００５，２３（９）：１１２６－１１３６．Lee Y C，Leu S J，Hung H C，et al．Adominant antigenic epitope on SARS-CoVspike protein identified by an avian single-chain variable fragment（scFv）-expressingphage［J］．Vet Immunol Immunopathol，２００７，１１７（１－２）：７５－８５．Hamasaki T，Uchida S，Yoshihara T，etal．Biopanning of antibody-phage clonesusing immunoplates coated with gel slicesof electrophoresis：immunogel-biopanning［J］．Biol Pharm Bull，２００７，３０（８）：１３６１－１３６４．Auf der Maur A，Escher D，Barberis A．Antigen-independent selection of stableintracellular single-chain antibodies［J］．FEBS Lett，２００１，５０８（３）：４０７－４１２．Emadi S，Barkhordarian H，Wang M S，etal．Isolation of a human single chainantibody fragment against oligomericalpha-synuclein that inhibits aggregationand prevents alpha-synuclein-inducedtoxicity［J］．J Mol Biol，２００７，３６８（４）：１１３２－１１４４．Hedley S J，Auf der Maur A，Hohn S，etal．An adenovirus vector with a chimericfiber incorporating stabilized single chainantibody achieves targeted gene delivery［J］．Gene Ther，２００６，１３（１）：８８－９４．Brereton H M，Chamberlain D，Yang R，et al．Single chain antibody fragments forocular use produced at high levels in acommercial wheat variety［J］．JBiotechnol，２００７，１２９（３）：５３９－５４６．Putalun W，Taura F，Qing W，et al．Anti-solasodine glycoside single-chain Fvantibody stimulates biosynthesis ofsolasodine glycoside in plants［J］．PlantCell Rep，２００３，２２（５）：３４４－３４９．Olton D，Li J，Wilson M E，et al．Nanostructured calcium phosphates（NanoCaPs）for non-viral gene delivery：influence of the synthesis parameters ontransfection efficiency［J］．Biomaterials，２００７，２８（６）：１２６７－１２７９．Preat V．Drug and gene delivery usingelectrotransfer［J］．Ann Pharm Fr，２００１，５９（４）：２３９－２４４．Bejjani R A，Andrieu C，Bloquel C，et al．Electrically assisted ocular gene therapy［J］．Surg Ophthalmol，２００７，５２（２）：１９６－２０８．钱锋，肖成祖．脂质体法和电穿孔法转染哺乳动物细胞研究［J］．生物化学与生物物理进展，１９９９，２６（３）：２８９－２９１．Strube R W，Chen S Y．Enhancedintracellular stability of sFv-Fc fusionintrabodies［J］．Methods，２００４，３４（２）：１７９－１８３．赵清涛，马龙祥，薜国柱，等．全人源性肝癌单链抗体的表达、纯化及功能鉴定［J］．细胞分子与分子免疫学杂志，２００７，２３（７）：６４９－６５１．Wuertzer C A，Sullivan M A，Federoff HJ．AAV delivered single-chain antibodiesas passive immuno-therapy for priondisease［J］．Molecular Therapy，２００５，１１（１）：３７３．Azemar M，Djahansouzi S，Jager E，et al．Regression of cutaneous tumor lesions inpatients intratumorally injected with arecombinant single-chain antibody-toxintargeted to ErbB２／HER２［J］．BreastCancer Res Treat，２００３，８２（３）：１５５－１６４．（收稿：２００８－０５－２７编辑：袁宁）［１］［２］［３］［４］［５］［６］［７］［８］［９］［１０］［１１］［１２］［１３］［１４］［１５］［１６］［１７］［１８］［１９］［２０］。