蛋白质变性与沉淀时
盐析沉淀蛋白质时
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
6实验1-2 蛋白质的性质实验
实验1－2 蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应一、目的和要求：1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、原理在水溶液中的蛋白质分子由表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类：（1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质，提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大变化，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中，加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、操作方法：（1）蛋白质的盐析加5％卵清蛋白溶液2毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀，倒出少量浑浊沉淀，加少量水，是否溶解？为什么？将管内溶液过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，再观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入3％AgNO31—2滴，振荡试管，有沉淀生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？注意使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时不可过量，否则引起沉淀的再溶解，不妨以实验验证之，取一支试管加入约1毫升蛋白质溶液，加入1％CuSO4观察至有沉淀，再继续加入过量的CuSO4，观察沉淀消失，当然也可用0.5％的醋酸铅进行验证。
（3）某些有机酸沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
生化论述题
1. 什么是蛋白质变性？简单叙述变性与沉淀的关系。
在某些理化因素作用下，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性。
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。
变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，但变性蛋白质容易沉淀。
2. 底物浓度对反应速度的影响答：在酶量恒定的情况下，酶促反应的速度主要取决于底物的浓度；底物浓度太低时，反应速度随着底物浓度的增加而上升，加大底物浓度，反应速度缓慢，底物进一步增高，反应速度不在随底物浓度的增加而加快，达到最大反应速度，此时酶的活性中心被底物饱和。
3. 请简述一下苹果酸-天冬氨酸穿梭的过程。
胞浆中生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者通过线粒体内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸转运体进入线粒体，又在线粒体内苹果酸脱氢酶的作用下重新生成草酰乙酸和NADH。
NADH进入NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化，生成2.5分子ATP。
线粒体内生成的草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶的作用生成天冬氨酸，后者经谷氨酸天冬氨酸转运体运出线粒体再转变成草酰乙酸，继续进行穿梭。
苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌组织中。
4. 糖异生过程是否为糖酵解的逆反应？为什么？糖异生不是糖酵解的逆反应。
糖酵解过程中有三步不可逆反应，在糖异生途径之中须由另外的反应和酶代替。
这三步反应是:①丙酮酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，有2个反应组成，分别由丙酮酸所化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化;②1，6-双磷酸果糖转变成6-磷酸果糖，由果糖双磷酸酶催化③6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖，由葡萄糖-6-磷酸酶催化5.什么是乳酸循环？乳酸循环的生理意义是？肌肉特别是在缺氧收缩时产生大量的乳酸,乳酸经血液运输到肝,在肝中进行经糖异生,再生成葡萄糖释入血液,可再回到肌肉,就构成乳酸循环。
乳酸循环的形成的是由肝脏和肌肉中的酶的特点所致。
蛋白质沉淀反应实验
蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质的沉淀反应一、目的和要求1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2、掌握几种沉淀蛋白质的方法3、了解蛋白质变性与沉淀的关系二、沉淀反应（一）原理在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。
但这种稳定的状态是有条件的。
在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：1、可逆沉淀反应沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。
在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。
属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。
2、不可逆沉淀反应蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
（二）盐析1、材料与试剂（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒2、操作方法（1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。
此沉淀物为球蛋白。
（2）取上清液于另一支试管。
（3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。
静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。
（4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。
（三）重金属盐沉淀重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀：重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。
实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
蛋白质的变性、凝固及沉淀
生物化学与分子生物学教研室
精品课件
实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
精品课件
主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
精品课件
变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利的保存 保护体内蛋白质
精品课件
蛋白质的胶体性质及沉淀:
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。
大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。
精品课件
实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；
② 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。
观察现象（
）
③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中；
④ 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）；
⑤ 比较两只试管现象（
）
精品课件
蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯
蛋白质的沉淀反应剖析
3．有机酸沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 沉淀的生成。
4．有机溶剂沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
5、乙醇引起的变性与沉淀： 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
试剂（mL）
试管编号
1
2
3
蛋白质溶液
1.0
1.0
1.0
pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液
1.0
—
—
0.1mol/L氢氧化钠溶液
—
1.0
—
0.1mol/L 盐酸溶液
—
—
1.0
95%乙醇
2.0
2.0
2.0
摇匀后，观察是否有沉淀生成。放置片 刻，向各管内加水4mL，然后在2，3号管中 各加1滴甲基红，观察颜色的变化。 接着2 号管用0.1mol/L醋酸溶液中和， 3号管用 0.05mol/L碳酸钠溶液中和，观察颜色的变 化和沉淀的生成。最后各管再加0.1mol/L盐 酸溶液数十滴，观察沉淀的再溶解。
观察沉淀是否溶解，为什么？ 向另一离心管的上清液添加硫酸铵粉末，边
加边搅，直至硫酸铵粉末不再溶解达到饱和为 止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置5min 后， 离心（3000r/min） 10min，倒去上清液，向 沉淀中加少量水，观察沉淀是否溶解。
2．重金属盐沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入 2滴3%硝酸银溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 指蛋白质分子的结
构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素 后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。例如大多数蛋 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（丙酮） 短时间作用于蛋白质等。提纯蛋白质时，常 用此类反应。
蛋白质的沉淀反应
3．有机酸沉淀蛋白质： ．有机酸沉淀蛋白质： 支试管， 蛋白质溶液， 取1支试管，加入 支试管 加入2mL蛋白质溶液，再加 蛋白质溶液 三氯乙酸溶液， 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 三氯乙酸溶液 振荡试管， 沉淀的生成。 沉淀的生成。 4．有机溶剂沉淀蛋白质： ．有机溶剂沉淀蛋白质： 支试管， 蛋白质溶液， 取1支试管，加入 支试管 加入2mL蛋白质溶液，再加 蛋白质溶液 乙醇。 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 乙醇 混匀，观察沉淀的生成。
试剂和器材 1. 试剂： 试剂：
(8) 0.1 mol/L盐酸溶液； 盐酸溶液； 盐酸溶液 (9) 0.1 mol/L氢氧化钠溶液； 氢氧化钠溶液； 氢氧化钠溶液 (10) 0.05 mol/L碳酸钠溶液； 碳酸钠溶液； 碳酸钠溶液 (11) 0.1 mol/L醋酸溶液； 醋酸溶液； 醋酸溶液 (12) 甲基红溶液； 甲基红溶液；
离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。 离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。 蛋白质变性后， 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳 定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。 ），并不析出 定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。 因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀， 因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀， 而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
2. 器材： 器材：Fra bibliotek离心机、离心管、试管、试管架、吸管、 离心机、离心管、试管、试管架、吸管、 滴管等。 滴管等。
四、结果： 结果：
写出实验过程中观察到的现象并加以解释。 写出实验过程中观察到的现象并加以解释。
试剂和器材 1. 试剂
(1) 蛋白质溶液： 蛋白质溶液： 新鲜鸡蛋清∶ 溶液=1∶ 新鲜鸡蛋清∶5% NaCl溶液 ∶9 溶液 (2) 饱和硫酸铵溶液； 饱和硫酸铵溶液； (3) 硫酸铵结晶粉末； 硫酸铵结晶粉末； (4) 3%硝酸银溶液； 硝酸银溶液； 硝酸银溶液 (5) 5%三氯乙酸溶液； 三氯乙酸溶液； 三氯乙酸溶液 (6) 95%乙醇； 乙醇； 乙醇 (7) 0.2 mol/L pH4.7醋酸 醋酸钠缓冲溶液； 醋酸-醋酸钠缓冲溶液 醋酸 醋酸钠缓冲溶液；
蛋白质沉淀反应ppt课件
精选ppt课件2021
6
（三）重金属盐类沉淀蛋白质
❖ 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类 (如 Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白 质结合成不 溶性盐而沉淀。
❖ 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常 用重金 属盐除去液体中的蛋白质。但应注意， 在使用某些 重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉 淀蛋白质时，不可 过量，否则将引起沉淀再 溶解。此时的溶解为生成 憎水胶体的缘故。
❖ 溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸 的作用最为灵敏而且特异。因此被用于蛋白质的首 选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物， 加热可除去。
精选ppt课件2021
8
三、实验材料
❖ 实验材料： 鸡卵清蛋白液，吸管（1mlx4， 2mlx4，0.5mlx1， 5mlx2），试管 （1.5x15cmx14），水浴锅，滴管，电炉
❖ 实验试剂： 苯酚（0.5%），硫酸铜（1%）， 硫酸铵固体，95%乙 醇，NaCl，醋酸铅，鞣 酸，苦味酸，冰醋酸
精选ppt课件2021
9
四、操作步骤
精选ppt课件2021
10
五、问题与讨论
❖ 1、本次实验结果如何？ ❖ 2、蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀有什么区别？
精选ppt课件2021
11
?蛋白质的变性与沉淀之间没有必然联系蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用二乙醇沉淀蛋白质三重金属盐类沉淀蛋白质四生物碱试剂沉淀蛋白质蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用?加盐类如硫酸铵硫酸钠氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜同时又中和了蛋白质分子的电荷因此使蛋白质产生沉淀这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析
精选ppt课件2021
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1％三氯醋酸、无水乙醇、NaCl（固体）
四、实验内容及操作步骤
（一）实验内容 1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质
2.乙醇沉淀蛋白质
（二）操作步骤及原理
1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质 1）实验原理
COO OH P NH 2 P
+
COO -
重 金属离子 M
+ P
COO -M +
NH 2 P COO H
H
+
COOH
酸 根X
NH 3
P
NH3
+
NH3 X
+
-
2）操作步骤
试剂（滴） 5% 蛋白质溶液 试管1 2滴 试管2 2滴 试管3 2滴
0.1mol/L NaOH
10% ZnSO4
2滴
20滴
—
—Hale Waihona Puke —20滴1% 三氯醋酸
现象
—
20滴
—
3）观察、记录实验现象，并解释之。
2.乙醇沉淀蛋白质
1）实验原理
乙醇溶解于水，破坏蛋白质
实验项目 蛋白质变性与沉淀 2学时
一、实验目的
1.掌握蛋白质变性与沉淀两者 的关系；
2.熟悉刻度吸量管的正确使用； 3.了解蛋白质变性与沉淀的原
理及各种沉淀方法。
二、实验原理
（一）蛋白质变性
蛋白质受某些物理或化学因 素的影响，空间结构发生改变，
生物活性丧失。称为蛋白质变性。
（二）蛋白质沉淀：
使蛋白质从溶液中析出的现象。
1、盐析 2、重金属盐沉淀
3、有机酸试剂沉淀法
4、有机溶剂沉淀法
维持蛋白质胶体溶液稳定因素： 1.水化膜
2.颗粒表面电荷
去除上述稳定因素可使蛋白质沉淀析出。
三、实验仪器与试剂
1.仪器
试管、刻度吸量管、洗耳球等。 2. 试剂
5％蛋白质溶液、 2.5％蛋白质溶液、
10％ZnSO4溶液、 0.1mol/LNaOH、
分子的水化膜，加入少量中性盐 抑制蛋白质的解离，使电荷减少，
沉淀更完全。
2）操作步骤
试剂（mL） 2.5%蛋白质溶液 结晶NaCl 无水乙醇 试管1 0.5 mL — 1mL 试管2 0.5 mL 数粒（适量） 1mL
现象
3）观察、记录实验现象，并解释之。
五、注意事项
1.试剂滴管不能交叉使用，防污染试剂 2.刻度吸量管不能交叉使用，否则污染
试剂，影响反应现象。
3.做完实验把试管和试管架洗干净，
桌面擦干净，登记签名。
4.值日生听老师安排，认真打扫，经老 师批准才能离开实验室。
六、思考题
为什么临床抢救重金属中毒患者用 鸡蛋清或牛奶？
下次实验： 激活剂和抑制剂对酶活性
的影响 实验报告可以下课交，最晚 明天交，请组长负起责任。
谢谢同学们配合！