蛋白质的沉淀与变性反应
蛋白质沉淀反应实验
蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质的沉淀反应一、目的和要求1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2、掌握几种沉淀蛋白质的方法3、了解蛋白质变性与沉淀的关系二、沉淀反应（一）原理在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。
但这种稳定的状态是有条件的。
在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：1、可逆沉淀反应沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。
在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。
属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。
2、不可逆沉淀反应蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
（二）盐析1、材料与试剂（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒2、操作方法（1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。
此沉淀物为球蛋白。
（2）取上清液于另一支试管。
（3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。
静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。
（4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。
（三）重金属盐沉淀重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀：重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。
蛋白质的沉淀与变性反应【精品-PDF】
蛋白质的沉淀与变性反应【精品-PDF】蛋白质是生物体中很重要的分子，在生物体内发挥着重要的功能。
它们在结构、催化、调节和运输等方面都扮演着重要角色。
由于蛋白质的复杂性和多样性，所以学习和研究蛋白质的性质和行为是生物学研究的重要组成部分。
本文将讨论蛋白质的沉淀与变性反应。
一、蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应指的是使蛋白质分子聚集在一起形成沉淀的反应。
蛋白质的沉淀反应的主要原理是利用电荷交互作用和疏水作用使蛋白质分子聚集在一起。
1.1 电荷交互作用在水中，蛋白质分子通常带有电荷，其电荷性质取决于溶液的pH值和它们的氨基酸成分。
当蛋白质分子之间存在相同或相似的电荷时，它们会互相排斥，保持分散状态；当它们之间存在不同的电荷时，它们会互相吸引，相互结合成为固体沉淀。
例如，在pH为4的条件下，青霉素酸根离子的电荷是负的，当加入凝集剂如硫酸铵时，会在离子力作用下形成固体沉淀。
另外，也可以在溶液中加入其他化学试剂，如硫酸铵、硝酸铵等，来诱导蛋白质分子的沉淀。
1.2 疏水作用另一个重要的蛋白质沉淀反应机制是疏水作用。
当蛋白质分子中的氨基酸侧链存在疏水性时，分子中的这些疏水残基会倾向于相互结合，从而使蛋白质分子形成有序排列。
这个过程通常涉及到一些小分子凝集剂的加入，如醇类，盐类等。
例如，溶液中添加适量的乙醇可使溶液中含有大量的脂肪酸的蛋白质沉淀。
这种沉淀反应常常用于蛋白质纯化和分离。
蛋白质的变性是指蛋白质的本来的构象、生物活性和物理化学性质发生改变的过程。
蛋白质变性可由多种因素引起，包括温度、酸碱度、离子强度、疏水剂、有机溶剂等。
蛋白质变性可以是可逆性的或不可逆性的。
2.1 温度变性温度变性是最常见的蛋白质变性过程之一。
在一定的温度范围内，蛋白质分子的完整性可保持不变。
但是，当温度升高时，分子的内部能量增加，导致其内部的氢键和范德华力变弱。
这些内部作用力弱化可能导致蛋白质分子的空间构象变化，最终使其失去生物功能。
例如，某种酶在它的最适活性温度下，还具有较高的稳定性。
实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
蛋白质的变性、凝固及沉淀
生物化学与分子生物学教研室
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实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
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主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
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变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利的保存 保护体内蛋白质
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蛋白质的胶体性质及沉淀:
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。
大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。
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实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；
② 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。
观察现象（
）
③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中；
④ 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）；
⑤ 比较两只试管现象（
）
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蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯
蛋白质的变性-沉淀-凝固
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蛋白质的变性/沉淀/凝固
蛋白质的变性/沉淀/凝固：
蛋白质的二级结构以氢键维系局部主链构象稳定，三、四级结构主要依赖于氨基酸残基侧链之间的相互作用，从而保持蛋白质的天然构象。
1.变性：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失的现象称为蛋白质的变性。
蛋白质变性后溶解度下降、容易消化生物活性丧失。
2.沉淀：蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。
蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集容易沉淀。
3.凝固：蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可医`学教育网搜集整理溶解于强酸和强碱中医|学教育网搜集整理。
如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。
4.复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。
蛋白质的性质实验原理和操作步骤-1-2
蛋白质的性质实验原理和操作步骤-1-22. 不可逆的沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。
变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。
蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子，如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2 + 、Fe3+结合成蛋白质盐。
在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。
经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。
重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。
因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质; 临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。
但应注意，过量的醋酸铅或硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。
蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而沉淀。
三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。
【实验试剂和器材】（一）试剂1. 卵清蛋白溶液：取5ml鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤,新鲜配制。
2. 0.5% 酪蛋白(以0.01N NaOH作溶剂)3. 酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20ml及1.00N NaOH溶液5ml (必须准确)。
摇荡使酪蛋白溶解。
然后加1.00N醋酸5ml ((必须准确)，倒入50ml 蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N醋酸钠溶液内，酪蛋白的浓度为0.5% 。
4. 蛋白质-NaCl溶液: 取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液1 00ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
重庆大学生物化学实验_实验七 蛋白质沉淀反应
3．向上述两试管的沉淀内各加蒸馏水5毫升，观 察沉淀能否复溶？为什么？
II. 用重金属沉淀蛋白质
原 理
？？？
•应注意 ？
在溶液的PH值大于蛋白质的等 电点时，带负电荷的蛋白质与重 金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、 Pb2+等）结合成盐而沉淀。
I．蛋白质的盐析作用
原 理
？？？
用高浓度的中性盐，使蛋白质带电荷 量减少，水化膜破坏蛋白质而从溶液中沉 淀出来。
盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白质变性， 故常用于分离各种天然蛋白质。
操作方法
1．取一试管加入盐析用蛋白质溶液和饱和硫酸 铵溶液各5毫升，混匀后静置数分钟，球蛋白即 沉淀析出。
叶酸（VB11）和四氢叶酸(FH4)
四氢叶酸是合成酶的辅酶，其前体是叶酸(又称为蝶酰谷氨酸，属 于维生素B11,绿叶中含量丰富)。
H
N NH
H2N
H
O
N
N
CH2 NH H
C
OH H
(2-氨4-羟6-亚甲基喋呤)
(对氨基苯甲酸)
COOH CH2 CH2 NH CH COOH
(谷氨酸)
四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3, -CH2-, -CHO 3%硝酸银液
结果
2
1 2
数滴
3
1 2
数滴
III．用“生物碱试剂”沉淀蛋白质
问题：1、什么叫生物碱与生物碱试剂？ 2、生物碱有什么生物学意义？ 3、为什么生物碱试剂能沉淀Pr?
蛋白质沉淀实验反思
蛋白质沉淀实验反思
反思：蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应一、目的和要求一、目的和要求1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2、掌握几种沉淀蛋白质的方法、掌握几种沉淀蛋白质的方法3、了解蛋白质变性与沉淀的关系、了解蛋白质变性与沉淀的关系二、沉淀反应二、沉淀反应（一）原理（一）原理在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。
但这种稳定的状态是有条件的。
在某些理化因素的作用下，蛋白稳定的胶体颗粒。
但这种稳定的状态是有条件的。
在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：个过程就称为蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：1、可逆沉淀反应、可逆沉淀反应沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。
蛋白质的变性沉淀反应
一、实验目的
（ 1 ）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的
认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实 用意义。 （3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水 化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在 一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去 电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为 两类。 （1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的 结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素 后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质 的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时
0.1 mol· L-1 盐酸溶液
95%乙醇
pH4.7 缓冲溶液
1 2 3
1 1 1
— — 1
1 1 1
1 — —
振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各 管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红， 再分别用0.1 mol· L-1醋酸溶液及0.05 mol· L-1碳酸钠溶 液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再 加0.1 mol· L-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释 各管发生的全部现象。
三、仪器、材料和试剂
实验材料和试剂
0.2%鸡蛋清溶液；pH4.7 醋酸醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银溶液； 5% 三氯乙酸溶液； 95% 乙醇；饱和硫 酸 铵 溶 液 ； 硫 酸 铵 结 晶 粉 末 ； 0.1 mol· L-1 盐酸溶液； 0.1 mol· L-1 氢氧 化钠溶液； 0.05 mol· L-1 碳酸钠溶液； 0.1 mol· L-1 醋酸溶液；甲基红溶液； 2% 氯 化 钡 溶 液 ； 10%NaOH ； 饱 和 的 NaCl；10%醋酸。
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實驗 3 蛋白質的沉澱與變性反應
目的
(1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。
(2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。
原理
在水溶液中，蛋白質分子的表面，由於形成水化層和雙電層而成為穩定
的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。
但是，蛋白質膠
體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。
在一定的物理化學因素影響下，蛋白
質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程
稱為蛋白質的沉澱反應。
這種反應可分為以下兩種類型:
一、可逆澱汲反應
在發生沉澱反應時，蛋白質雖已沉澱析出，但它的分子內部結構並未發
生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉澱因素除去後，能再溶於原來的溶
劑中。
這種作用稱為可逆沉澱反應，又叫作不變性沉澱反應。
屬於這一類的
反應有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等
電點的沉澱等。
二、不可逆沉澱反應
在發生沉澱反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原
來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。
這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解
於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。
重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、
過鹼、加熱、震盪、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。
試劑和器材
一、試劑
1．蛋白質溶液
取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻後用4-8層紗
布過濾，新鮮配製。
2．蛋白質氯化鈉溶液
取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻
後，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。
硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10% 三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid)，0.1%
硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，飽和氯化鈉溶液，10%
氫氧化鈉溶液。
二、器材
試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml
燒杯，10 ml量筒。
操作方法
一、蛋白質的可逆沉澱反應蛋白質的鹽析作用
用大量中性鹽使蛋白質從溶液中沉澱析出的過程稱為蛋白質的鹽析作用。
蛋白質是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質分子被鹽脫去水化層，同時蛋白質分子所帶的電荷被中和，結果蛋白質的膠體穩定性遭受破壞而沉澱析出。
析出的蛋白質仍保持其天然蛋白質的性質。
減低鹽的濃度時，還能溶解。
沉澱不同的蛋白質所需中性鹽的濃度不同，而鹽類不同也有差異。
例如:向含有白蛋白和球蛋白的雞蛋清溶液中加硫酸鎂或氯化鈉至飽和，則球蛋白沉澱析出。
加硫酸錢至飽和，則白蛋白沉澱析出。
另外，在等電點時，白蛋白可被飽和硫酸鎂或氯化鈉或半飽和的硫酸銨溶液沉澱析出。
所以在不同條件下，用不同濃度的鹽類可將各種蛋白質從混合溶液中分別沉澱析出，該法稱為蛋白質的分級鹽析。
目前在醃的生產和製備、科學研究工作和臨床化驗等工作中廣泛應用。
取一支試管加入3m1蛋白質氯化鈉溶液和3m1飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10 min，球蛋白則沉澱析出，過濾後向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，達到飽和為止。
析出的沉澱為白蛋白。
靜置，倒去上部清液，白蛋白沉澱，取出部分加水稀釋，觀察它是否溶解，留存部分作透析用。
二、蛋白質的不可逆沉激反應
1．重金屬沉澱蛋白質
重金屬鹽類易與蛋白質結合成穩定的沉澱而析出。
蛋白質在水溶液中是酸鹼兩性電解質，在鹼性溶液中(對蛋白質的等電點而言)，蛋白質分子帶負電荷，能與帶正電荷的金屬離子結合成蛋白質鹽。
在有機體內，蛋白質常以其可溶性的鈉鹽或鉀鹽的形式存在，當加入汞，鉛、銅、銀等重金屬鹽時，則蛋白質形成不溶性的鹽類而沉澱。
經過這種處理後的蛋白質沉澱不再溶解於水中，說明它已發生了變性。
重金屬鹽類沉澱蛋白質的反應通常很完全，特別是在鹼金屬鹽類存在時。
因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體液中的蛋白質;臨床上用蛋白質解除重金屬鹽的食物性中毒。
但應注意，使用醋酸鉛或硫酸銅沉澱蛋白質時，試劑不可加過量，否則可使沉澱出的蛋白質重新溶解。
取2支試管，各加入約1m1蛋白質溶液，分別加入3 % 硝酸銀3-4滴，0.5% 醋酸鉛1-3滴和0.1%硫酸銅3-4滴，觀察沉澱的生成。
第一、二支試管再分別加入過量的醋酸鉛和飽和硫酸銅溶液，觀察沉澱的再溶解。
2．有機酸沉澱蛋白質
有機酸能使蛋白質沉澱。
三氯醋酸和磺基水楊酸最有效，能將血清等生物體液中的蛋白質完全除去，因此得到廣泛使用。
取兩支試管，各加入蛋白質溶液約0.5 m1，然後分別滴加10% 三氯醋酸和5%磺基水楊酸溶液各數滴，觀察蛋白質的沉澱。
3．無機酸沉澱蛋白質
濃無機酸(除磷酸外)都能使蛋白質發生不可逆的沉澱反應。
這種沉澱作用可能是蛋白質顆粒脫水的結果。
過量的無機酸(硝酸除外)可使沉澱出的蛋白質重新溶解。
臨床診斷上，常利用硝酸沉澱蛋白質的反應，檢查尿中蛋白質的存在。
取3支試管，分別加入濃鹽酸15滴，濃硫酸、濃硝酸10滴。
小心地向3支試管中，沿管壁加入蛋白質溶液6滴，不要搖動，觀察各管內兩液界面處有白色環狀蛋白質沉澱出現。
然後，搖動每個試管。
蛋白質沉澱應在過量的鹽酸及硫酸中溶解。
在含硝酸的試管中，雖經振盪，蛋白質沉澱也不溶解。
4．加熱沉澱蛋白質
幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固，變成不可逆的不溶狀態。
鹽類和氫離子濃度對蛋白質加熱凝固有重要影響。
少量鹽類促進蛋白質的加熱凝固。
當蛋白質處於等電點時，加熱凝固最完全、最迅速。
在酸性或鹼性溶液中，蛋白質分子帶有正電荷或負電荷，雖加熱蛋白質也不會凝固。
若同時有足量的中性鹽存在，則蛋白質可因加熱而凝固。
取5支試管。
編號，按下表加入有關試劑(單位:滴):
將各管混勻，觀察記錄各管現象後，放人沸水浴中加熱10 min，注意觀察比較各管的沉澱情況。
然後將第3，4，5號管分別用10% NaOH或10% 醋酸中和，觀
察並解釋實驗結果。
將3，4，5號管繼續分別加入過量的酸或鹼，觀察它們發生的現象。
然後，用過量的酸或鹼中和第3，5號管，沸水浴加熱10 min，觀察沉澱變化，檢查這種沉澱是否溶於過量的酸或鹼中，並解釋實驗結果。
問題:
1．為什麼蛋清可用作鉛中毒或汞中毒的解毒劑?
2．蛋白質分子中的哪些基團可以與
(1)重金屬離子作用而使蛋白質沉澱?
(2)有機酸、無機酸作用而使蛋白質沉澱?
3．高濃度的硫酸銨對蛋白質溶解度有何影響，為什麼?
4．在蛋白質可逆沉澱反應的實驗中，為何要用蛋白質氯化鈉溶液?。