蛋白质变性与沉淀
生化论述题
1. 什么是蛋白质变性？简单叙述变性与沉淀的关系。
在某些理化因素作用下，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性。
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。
变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，但变性蛋白质容易沉淀。
2. 底物浓度对反应速度的影响答：在酶量恒定的情况下，酶促反应的速度主要取决于底物的浓度；底物浓度太低时，反应速度随着底物浓度的增加而上升，加大底物浓度，反应速度缓慢，底物进一步增高，反应速度不在随底物浓度的增加而加快，达到最大反应速度，此时酶的活性中心被底物饱和。
3. 请简述一下苹果酸-天冬氨酸穿梭的过程。
胞浆中生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者通过线粒体内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸转运体进入线粒体，又在线粒体内苹果酸脱氢酶的作用下重新生成草酰乙酸和NADH。
NADH进入NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化，生成2.5分子ATP。
线粒体内生成的草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶的作用生成天冬氨酸，后者经谷氨酸天冬氨酸转运体运出线粒体再转变成草酰乙酸，继续进行穿梭。
苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌组织中。
4. 糖异生过程是否为糖酵解的逆反应？为什么？糖异生不是糖酵解的逆反应。
糖酵解过程中有三步不可逆反应，在糖异生途径之中须由另外的反应和酶代替。
这三步反应是:①丙酮酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，有2个反应组成，分别由丙酮酸所化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化;②1，6-双磷酸果糖转变成6-磷酸果糖，由果糖双磷酸酶催化③6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖，由葡萄糖-6-磷酸酶催化5.什么是乳酸循环？乳酸循环的生理意义是？肌肉特别是在缺氧收缩时产生大量的乳酸,乳酸经血液运输到肝,在肝中进行经糖异生,再生成葡萄糖释入血液,可再回到肌肉,就构成乳酸循环。
乳酸循环的形成的是由肝脏和肌肉中的酶的特点所致。
蛋白质的沉淀与变性反应【精品-PDF】
蛋白质的沉淀与变性反应【精品-PDF】蛋白质是生物体中很重要的分子，在生物体内发挥着重要的功能。
它们在结构、催化、调节和运输等方面都扮演着重要角色。
由于蛋白质的复杂性和多样性，所以学习和研究蛋白质的性质和行为是生物学研究的重要组成部分。
本文将讨论蛋白质的沉淀与变性反应。
一、蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应指的是使蛋白质分子聚集在一起形成沉淀的反应。
蛋白质的沉淀反应的主要原理是利用电荷交互作用和疏水作用使蛋白质分子聚集在一起。
1.1 电荷交互作用在水中，蛋白质分子通常带有电荷，其电荷性质取决于溶液的pH值和它们的氨基酸成分。
当蛋白质分子之间存在相同或相似的电荷时，它们会互相排斥，保持分散状态；当它们之间存在不同的电荷时，它们会互相吸引，相互结合成为固体沉淀。
例如，在pH为4的条件下，青霉素酸根离子的电荷是负的，当加入凝集剂如硫酸铵时，会在离子力作用下形成固体沉淀。
另外，也可以在溶液中加入其他化学试剂，如硫酸铵、硝酸铵等，来诱导蛋白质分子的沉淀。
1.2 疏水作用另一个重要的蛋白质沉淀反应机制是疏水作用。
当蛋白质分子中的氨基酸侧链存在疏水性时，分子中的这些疏水残基会倾向于相互结合，从而使蛋白质分子形成有序排列。
这个过程通常涉及到一些小分子凝集剂的加入，如醇类，盐类等。
例如，溶液中添加适量的乙醇可使溶液中含有大量的脂肪酸的蛋白质沉淀。
这种沉淀反应常常用于蛋白质纯化和分离。
蛋白质的变性是指蛋白质的本来的构象、生物活性和物理化学性质发生改变的过程。
蛋白质变性可由多种因素引起，包括温度、酸碱度、离子强度、疏水剂、有机溶剂等。
蛋白质变性可以是可逆性的或不可逆性的。
2.1 温度变性温度变性是最常见的蛋白质变性过程之一。
在一定的温度范围内，蛋白质分子的完整性可保持不变。
但是，当温度升高时，分子的内部能量增加，导致其内部的氢键和范德华力变弱。
这些内部作用力弱化可能导致蛋白质分子的空间构象变化，最终使其失去生物功能。
例如，某种酶在它的最适活性温度下，还具有较高的稳定性。
实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
蛋白质的变性、凝固及沉淀
生物化学与分子生物学教研室
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实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
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主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
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变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利的保存 保护体内蛋白质
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蛋白质的胶体性质及沉淀:
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。
大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。
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实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；
② 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。
观察现象（
）
③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中；
④ 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）；
⑤ 比较两只试管现象（
）
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蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯
蛋白质的变性-沉淀-凝固
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蛋白质的变性/沉淀/凝固
蛋白质的变性/沉淀/凝固：
蛋白质的二级结构以氢键维系局部主链构象稳定，三、四级结构主要依赖于氨基酸残基侧链之间的相互作用，从而保持蛋白质的天然构象。
1.变性：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失的现象称为蛋白质的变性。
蛋白质变性后溶解度下降、容易消化生物活性丧失。
2.沉淀：蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。
蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集容易沉淀。
3.凝固：蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可医`学教育网搜集整理溶解于强酸和强碱中医|学教育网搜集整理。
如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。
4.复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。
《生物化学简明教程》附带的习题答案zq整理版
《生物化学简明教程》附带的习题答案（一）用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？解答：（1）N-末端测定法：常采用2，4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
（二）何谓蛋白质的变性与沉淀？二者在本质上有何区别？解答：蛋白质的变性：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变的作用。
变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。
蛋白质变性后的表现：①生物学活性消失②理化性质改变：溶解度下降，黏度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
沉淀机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。
蛋白质的沉淀可以分为两类：（1）可逆的沉淀：蛋白质的结构未发生显著的变化，除去引起沉淀的因素，蛋白质仍能溶于原来的溶剂中，并保持天然性质。
（2）不可逆沉淀：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质变性而沉淀，不再能溶于原溶剂。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在，并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已经变性。
（三）一个α螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？计算该α-螺旋片段的轴长。
解答：180/3.6=50圈，50×0.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。
（五）如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4 × 109个碱基对。
试计算人体DNA 的总长度是多少？是太阳―地球之间距离(2.2 × 109 km)的多少倍？已知双链DNA每1000个核苷酸重1 ×10-18g，求人体DNA的总质量。
蛋白质变性与沉淀
如果能除去其水化膜并中和其电荷，则蛋白质可从溶液中沉淀出来。单独使用脱水剂（如乙醇、丙酮、硫酸钠等）破坏其水化膜或调整pH使其达到蛋白质的等电点，消除其电荷，都不能使蛋白质立即沉淀。只有两者合用，才能有效地沉淀蛋白质。常用的沉淀试剂有中性盐、有机溶剂、某些沉淀生物碱的试剂、重分子酸类及重金属盐类。
蛋白质有可逆变性 变性并未破坏一级结构，因此在蛋白质变性开始不久，构象变化较小时，去除变性剂后，又可恢复其一定变性
（4）重金属盐：蛋白质在碱性溶液中（pH＞pI）带负电荷，能与带正电荷的重金属离子如汞、铅、铜、银等结合生成不溶性沉淀。此种沉淀蛋白质都已变性。临床上常用口服大量牛乳并用催吐剂抢救误服重金属中毒的病人
2. 蛋白质的变性
蛋白质的变性 在某些物理或化学因素作用下，使蛋白质的空间构象破坏（但不包括肽链的断裂等一级结构的变化），导致蛋白质若干理化性质（如溶解度、粘度、吸收光谱、电泳行为等）和生物学性质（如催化活性、免疫学特性等）的改变，这种现象称为蛋白质的变性。
（1）盐析： 高浓度中性盐沉淀水溶液中的蛋白质，称为盐析。
（2）有机溶剂沉淀：乙醇和丙酮等有机溶剂在蛋白质溶液处于等电点时加入，能破坏蛋白质颗粒的水化膜使蛋白质沉淀，但沉淀过程必须保持低温，否则会引起蛋白质变性。
（3）沉淀生物碱的试剂：蛋白质在酸性溶液中（pH＜pI）带正电荷，能与沉淀生物碱的试剂（苦味酸、鞣酸、钨酸等）及三氯乙酸、磺基水杨酸、浓硝酸等酸根部分作用而析出沉淀。此种析出的蛋白质多已变性。
蛋白质变性与沉淀
三、实验内容原理及操作步骤
（一）实验内容 1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质
2.乙醇沉淀蛋白质
（二）操作步骤及原理
1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质 1）实验原理
COO OH P NH 2 P
+
COO -
重 金属离子 M
+ P
COO -M +
NH 2 P COO H
H
+
COOH
酸 根X
NH 3
P
NH3
沉淀更完全。
2）操作步骤
试剂（mL） 2.5%蛋白质溶液 结晶NaCl 无水乙醇 试管1 0.5 mL — 1mL 试管2 0.5 mL 数粒（适量） 1mL
现象
3）观察、记录实验现象，并解释之。
五、注意事项
1.试剂滴管不能交叉使用，防污染试剂 2.刻度吸量管不能交叉使用，否则污染
试剂，影响反应现象。
3.做完实验把试管和试管架洗干净，
桌面擦干净，登记签名。
4.值日生听老师安排，认真打扫，经老 师批准才能离开实验室。
六、思考题
为什么临床抢救重金属中毒患者用 鸡蛋清或牛奶？
一、实验目的
1.掌握蛋白质变性与沉淀两者 的关系；
2.熟悉刻度吸量管的正确使用； 3.了解蛋白质变性与沉淀的原
理及各种沉淀方法。
二、实验仪器与试剂
1.仪器
试管、刻度吸量管、洗耳球等。 2. 试剂
5％蛋白质溶液、 2.5％蛋白质溶液、
10％ZnSO4溶液、 0.1mol/LNaOH、
1％三氯醋酸、无水乙醇、NaCl（固体）
实验项目 蛋白质变性与沉淀 2学时
蛋白质变性
蛋白质受某些物理或化学因 素的影响，空间结构发生改变，
蛋白质的变性
蛋白质的变性
物理或者化学因素的影响下，蛋白质分子的空间结构遭到破坏
1，生物活性丧失，在一定条件下还能复性。
2，溶解度降低，变性以后不能溶解。
3，旋光性变化
蛋白质的沉淀
1，硫酸铵
2，硫酸铜
3，乙醇
4，苦味酸
1）盐析后的蛋白质不变性。
具有生物学活性。
2）有机溶剂沉淀==酒精，丙酮。
如果在低温下，时间比较短也是不变性的。
3）重金属盐沉淀==汞，银。
可使蛋白质变性，溶液的ph值大于等电点。
带正电荷
4）生物碱试剂沉淀==苦味酸等。
蛋白质变性，溶液的ph值小于等电点，溶液带正电荷，。
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2.试剂 5％蛋白质溶液、 2.5％蛋白质
溶液、10％ZnSO4溶液、 o.1mol/LNaOH、 1％三氯醋酸、无 水乙醇、NaCl（固体）
四、实验内容及操作步骤 （一）实验内容 1.重金属盐及有机酸类沉淀蛋白质 2.乙醇沉淀蛋白质
（二）操作步骤
1.重金属盐及有机酸类沉淀蛋白质
去除上述稳定因素可使蛋白质沉淀 析出。
蛋白质沉淀析出常用的方法有等 电点法、盐析法、重金属离子沉淀 法、有机酸试剂沉淀法、有机溶剂 沉淀法等。
（二）蛋白质变性原理
蛋白质受某些物理或化学因素 的影响，空间结构发生改变，生 物活性丧失。称为蛋白质变性。
蛋白质变性，分可逆；不可逆。
三、实验仪器与试剂
六、思考题
1.临床抢救重金属中毒患者，为 什么用鸡蛋清或牛奶？
2.蛋白液中加入适量乙醇，为什 么会产生沉淀？
3.蛋白液在碱性条件下加入 ZnSO4 ，为什么会产生沉淀？
4.蛋白液中加入三氯醋酸 ，为 什么会产生沉淀？
下次实验： P74页
激活剂及抑制剂对酶活性的影响
实验报告明天交，请组长负起责 任。谢谢同学们配合！
1）实验原理
负电荷
OHCOO-
COOP
pH > pI NH2
重金属离子M+
P
H+ NH3+
COOH P
pI pH < pI NH + 3
两性离子 正电荷
酸根X-
盐↓
COO-M+
P NH
2
COOH
P NH3+X-
盐↓
2）操作步骤
试剂（滴） 5%蛋白质溶液 0.1mol/L NaOH
10% ZnSO4 1%三氯醋酸
溶液 结晶NaCl 无水乙醇
现象
试管1 0.5 mL
— 1mL
试管2
0.5 mL 数粒（适量）
1mL
3）观察、记录实验现象，并解释之。
五、注意事项 1.试剂瓶滴管不能交叉使用，否则污 染试剂。 2.刻度吸量管不能交叉使用，否则污 染试剂，影响反应现象。 3. 做完实验把把试剂按原样摆放，试 管和刻度吸量管冲洗干净，桌面擦干净， 登记签名。 4.值日生听老师安排，认真打扫，经 老师批准才能离开实验室。
下次实验： P70页
酶的特异性
实验报告可以下课交， 最晚明天交，请组长负起 责任。谢谢同学们配合！
实验项目 蛋白质变性与沉淀
一、实验目的
1.掌握蛋白质变性与沉淀 的原理及各种沉淀方法； 2.熟悉刻度吸量管的正确 使用； 3.了解蛋白质变性与沉淀 两者的关系。
二、实验原理
（一） 蛋白质沉淀原理
蛋白质溶于水形成稳定的胶体溶液， 维持蛋白质胶体溶液稳定因素：
1.蛋白质颗粒表面的水化膜；
2.蛋白质颗粒表面的电荷。
试管1 2D 2D 20D —
现象
试管2 2D — — 20D
试管3 2D — 20D —
3）观察、记录实验现象，并解释之。
2. 乙醇沉淀蛋白质 1）实验原理 乙醇溶解于水，破坏蛋白 质分子的水化膜，加入少量中 性盐抑制蛋白质的解离，使电 荷减少，沉淀更完全。
2）操作步骤
试剂（mL） 2.5%蛋白质