番茄叶色黄化突变体的遗传分析及SSR分子标记[1]

中国蔬菜 2010（14）：31-35CHINA VEGETABLES番茄叶色黄化突变体的遗传分析及SSR分子标记郭 明 张 贺 李景富*（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘 要：在番茄普通栽培品种中蔬4号06884中发现能稳定遗传的叶色黄化突变体06883，该突变体新出叶最初为绿色，四叶一心时第一片真叶开始转黄，果实转色慢，硬度大耐贮藏。

通过该突变体和栽培品种中蔬4号的正反交试验的遗传分析证明，该突变材料的叶片黄化性状由1对隐性主效核基因控制，该性状可以用来作为指示性状鉴定杂种纯度。

应用SSR分子标记技术对该突变基因进行初步定位，经连锁分析表明，该基因与LEaat006、LEtat002和Tom196-197连锁，与它们的连锁距离分别为8.9、16.3和18.7 cM。

关键词：番茄；叶色黄化突变；SSR；基因定位中图分类号：S634 文献标识码：A 文章编号：1000-6346（2010）14-0031-05 Genetic Analysis and SSR Molecule Marker on Tomato Yellow Leaf MutantGUO Ming, ZHANG He, LI Jing-fu*（College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China） Abstract：A natural yellow leaf mutant named 06883, found in tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）variety‘Zhongshu No.4’, can be inherited stably. Originally the leaves were green, but the first true leaf color turned into yellow during the period of four leave and one shoot. The fruits turned to red slowly, and became hard which is good for storage. The mutant was reciprocally crossed with tomato variety ‘Zhongshu No.4’, and the genetic analysis indicated that the mutant is nucleolus inheritance and controlled by one recessive gene. It can be used as a phonotypical marker to identify purity of F1 hybrids. We roughly mapped the mutant gene using SSR molecular markers. Three SSR markers LEaat006, LEtat002 and Tom196-197 were linked to the mutant gene. They were 8.9 cM, 16.3 cM and 18.7 cM apart from the mutant gene, respectively.Key words：Tomato; Yellow leaf mutant; Simple sequence repeat（SSR）marker; Molecular mapping叶色突变是自然界比较常见的一种突变，由于突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体（何冰 等，2006）。

对叶色突变的研究开始得较早，在20世纪30年代就有报道，在水稻（吴殿星 等，1997）、大豆（Honeycutt et al.，1990；马国荣 等，1994）、大麦（史俊通 等，1998）、小麦（苏小静 等，1990）、棉花（肖松华 等，1995）、西瓜（Whitaker，1952）等多种作物中获得了此类突变体。

研究表明，叶色突收稿日期：2010-02-01；接受日期：2010-03-03基金项目：国家“863”计划项目（2007AA10Z-178），东北农业大学创新团队项目（CXT002）作者简介：郭明，女，硕士，专业方向：蔬菜学，E-mail：gm_523@* 通讯作者（Corresponding author）：李景富，教授，专业方向：蔬菜遗传育种与分子生物技术研究，E-mail：lijf_2005@32 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2010年7月（下）变体作为一种特殊的材料，对研究高等植物的光合机理（Fambrini et al.，2004）、叶绿素的生物合成、叶绿体的结构、功能与发育以及它们的分化和遗传控制（Parks & Quail，1991）、分析鉴定基因功能（Hansson et al.，1999）、了解基因间互作（Lopez-Juez et al.，1998）有特殊价值，同时在育种工作中，叶色突变作为标记性状用于简化良种繁育和杂交制种，在生产实践中具有重要的意义。

国内外关于叶色突变体的研究主要集中在水稻、小麦等大田作物，而关于番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）叶色突变的报道较少。

Terry和Kendrick（1999）报道番茄黄叶突变体au和yg-2为核隐性基因突变，分别是血红色素加氧酶和植物光敏色素合酶基因发生突变。

王彦杰等（2007）以叶黄素缺失的番茄突变体为材料，研究叶黄素合成突变与光能分配和抗氧化酶活性的关系，结果表明叶黄素缺失体主要通过降低光能吸收和提高抗氧化能力来避免过剩光能导致光氧化胁迫的产生。

东北农业大学番茄课题组于1998年在田间露地种植的中蔬4号中发现自然突变的番茄叶色突变株，该突变株叶色黄化，成株苗叶片有黄斑，结果前期果实发白，转色慢，但果实能正常转为红色，果实硬度大。

将该突变株单独留种，经过多代自交形成遗传稳定的黄叶突变系。

发现初期以果实颜色命名该突变体为番茄“白化”突变体（李景富 等，2006），后更名为番茄叶色黄化突变体。

本试验对该番茄叶色黄化突变体的遗传和相关基因的初步定位进行研究，旨在为今后该基因的精细定位、克隆及其在育种中的应用奠定基础。

1材料与方法1.1供试番茄材料及遗传分析和定位群体的构建突变体材料：番茄叶色黄化突变体06883，系番茄中蔬4号06884中发现的自然突变株，经6 a观察，突变性状能够稳定遗传。

常规材料：中蔬4号06884，栽培品种04973。

以上材料均由东北农业大学番茄研究所提供。

利用番茄叶色黄化突变体06883与中蔬4号配制正反杂交组合，F1自交获得F2。

F2群体用于番茄叶色黄化性状的遗传分析。

将番茄叶色黄化突变体06883与04973杂交。

F1自交获得F2，该群体用于相关基因的分子定位。

1.2遗传分析方法利用人工去雄、授粉的常规有性杂交法，将叶色黄化突变体与中蔬4号进行正反交试验。

F1单粒留种，单株收获并贮藏。

在苗期分别观察统计F1、F2表型和植株数，并对统计结果进行χ2检测。

1.3DNA的提取取番茄鲜嫩叶片，采用CTAB法提取亲本和群体单株DNA，参照王关林和方宏筠（2002）的方法略作修改。

用Eppendouf蛋白核酸测定仪测定DNA浓度，然后用去离子水将其稀释至50 ng·μL-1。

1.4番茄黄化突变基因的SSR分子标记共选用339对SSR引物用于筛选与叶色黄化突变基因连锁的标记，SSR引物序列分别来自SOL Genomics Network（http：///index.pl）及文献（Suliman-Pollatschek et al.，2002；He & Poysa，2003），覆盖番茄的12条染色体，能够对叶色黄化突变基因进行初步定位。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

反应体系：模板DNA 20 ng，1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol·L-1，MgCl2 2.0 mmol·L-1，引物0.3 μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1 U，加ddH2O补至20 μL。

在BiometraPCR仪上进行扩增，反应条件为：94 ℃下预变性5 min，94 ℃下变性1 min，Tm值（45～55 ℃）下退火1 min，72 ℃下延伸2 min，38个循环；最后72 ℃下延伸10 min后保存在4 ℃条件下。

反应产物加入5 μL变性液，在PCR仪中95 ℃变性5 min后立即置于冰水2010（14） 郭 明等：番茄叶色黄化突变体的遗传分析及SSR分子标记 33 混合物中。

用6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V电泳约1 h。

最后银染显色分析。

1.5数据分析SSR为共显性标记，分离后代同父本04973的纯和带型记为“1”，同母本06883的纯和带型记为“2”，两亲本的杂合带型记为“3”，带型模糊或缺失记为“0”。

利用Mapmaker/EXP 3.0构建分子标记连锁图谱，应用Mapchart 2.1软件绘制遗传图谱。

2结果与分析2.1叶色黄化突变体的表型特征06883叶色黄化突变体经连续6 a观察，群体均表现出黄化，无分离现象，性状稳定。

该突变体子叶颜色展平时与正常植株一样为绿色，约10 d后，突变体子叶颜色渐渐变黄，且颜色均匀。

随着苗龄的延长，新出的真叶为正常绿色，至四叶一心期，第一片真叶从叶尖边缘向叶基部开始失绿，直至整个叶片变黄，最后衰老、死亡的叶片颜色几乎为白色。

在植株生长过程中，叶片变黄的同时，主茎颜色也由绿色慢慢变成黄色，且靠近土壤的植株茎部颜色呈淡紫红色。

叶色黄化突变体与正常植株叶色有明显差异，表现出不同程度的黄化现象，由下至上，黄化程度依次减弱，仅新出叶片为绿色，而突变体与正常植株在生长势上没有显著差异。

突变体果实呈白色，转色非常慢，但成熟后期能够转为红色，且果实产量与中蔬4号06884差异不显著，硬度大，耐贮藏。

2.2叶色黄化突变体的遗传分析叶色黄化突变体06883与中蔬4号的正反交试验显示，F1群体均表现为正常植株叶色，观察结果说明叶色黄化性状为隐性性状。

其F2群体均分化出叶色黄化突变株和正常绿色株两种类型，说明叶片黄化性状受主效基因控制。

F2中绿叶和黄化叶的分离比值都接近3∶1（表1），卡方测验差异均不显著。