脐带间充质干细胞研究进展

的表达及NAC的干预作用［J］.黑龙江医药科学，2005，28（6）：30-31.［23］路浩，达剑森，梅莉，等.母鼠妊娠期铅镐联合暴露对仔鼠脑组织的氧化损伤及乙酰半胱氨酸的保护效应［J］.中国兽医科学，2008，38（1）：42-45.［24］FLORA G J，SETH P K.Beneficial effects of S-adenosyl-Lme⁃thionine on aminolevulinic acid hydratase，glutathione and lipidperoxidation during acute lead-ethanol administration in mice［J］.Alcohol，1999，18（2/3）：103-108.（收稿日期：2010-02-08　编辑：张素文）脐带间充质干细胞研究进展蒋洁1，张雪梅1，张建湘21怀化医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室（湖南怀化418000）；2中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎学系（长沙410013） 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件控制下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等［1］，在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值。

目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。

脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为干细胞领域的研究热点。

本文就近年来国内外在脐带间充质干细胞方面的相关研究进行总结和分析，对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特性以及分化能力等问题作简要综述。

1　脐带MSCs的来源与分离1.1　脐带MSCs的来源　脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞［2］，其中间充质干细胞来源分4种：（1）来源于Wharton’s jelly（WJ）［3-4］；（2）来源于脐血管周围；（3）来源于脐血；（4）来源于脐静脉血管内皮下［5-6］。

KAVIANI等［7］研究发现脐带血可能含有与骨髓类似的MSCs。

ERICES等［2］首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，虽然其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，但在处理的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞（mesenchymal-like cell，MLC）。

WEXLER等［8］研究发现脐血标本仅产生少量、非融合、异质的贴壁细胞层，这提示脐血中MSCs较稀少，脐血标本并不是MSC的丰富来源。

GOODWIN等［9］认为可以从脐带血中分离出间充质样干细胞，但是培养时间较长，需要保持酸性培养环境。

随着对脐带血间充质干细胞研究的深入，大家的结论也越来越趋于一致，脐血中的确存在着MSCs，但其所占比例较骨髓低的多，脐带血和外周血并非间充质干细胞的最佳来源。

另一方面，SARUGASER等［5］发现培养后的人脐带血管外周（HUCPV）细胞呈现较高水平的成纤维样集落形成（CFU-F），进行骨诱导后，细胞快速增殖并分化形成骨结节。

COVAS等［10］从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于BMSC的细胞，并表现出向脂肪和骨原分化的潜能。

覆盖于WJ组织表面的脐带上皮（UCE）细胞被认为是来源于羊膜上皮组织。

MIZOGUCHI等［11］对UCE 细胞进行分离培养时发现干细胞特征的细胞，该细胞不仅表达单层和黏液上皮角蛋白，而且还表达复层上皮角蛋白，能够转化和表达表皮细胞的表型。

1.2　脐带MSCs的分离　脐带间充质干细胞的培养并非易事，特别是如何快速、高效地从脐带中获得MSCs以满足基础和未来临床研究的需要是一个亟待解决的问题。

目前，间充质干细胞的体外分离方法主要有：（1）贴壁培养筛选法；（2）密度梯度离心法；（3）流式细胞仪或免疫磁珠分选法。

贴壁培养筛选法主要是利用MSCs对培养瓶具有较强的黏附能力，而造血系细胞、内皮细胞等不贴壁，在以后的换液中逐渐被弃去，达到分离纯化干细胞的目的。

密度梯度离心法是根据MSCs与其他细胞的密度不同来进行分离，如广泛采用的Percoll密度梯度离心法。

随着对MSCs表面抗原认识的深入，也有人利用免疫方法如流式细胞仪分选法、免疫磁珠法等分离MSCs，此方法是根据细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志进行分离。

在贴壁培养筛选法方面，酶消化法的使用较为广泛。

如WANG等［4］将去除脐血管的脐带组织，用刀片刮除WJ组织，胶原酶消化16h，培养3d后可观察到成纤维样细胞生长。

SARUGASE等［5］将包裹WJ基质的脐血管两端用缝线结扎呈环状，于胶原酶消化获得的细胞进行培养，倒置相差显微镜下可以观察到星形的成纤维样细胞。

ROMANOV等［12］通过对脐带血管系统行酶消化，获得血管内皮和内皮下混合细胞群体，培养7d后可观察到成纤维样细胞。

2　脐带MSCs的生物学特性2.1　细胞形态与增殖特性　取脐带间质组织剪碎后经酶消化，细胞贴壁后观察细胞形态呈长的扁平的梭形，类似成纤维细胞，传代后的细胞形态无明显变化［4］。

MA等［13］将人脐带WJ行组织块培养，原代培养时间为10~14d，传代后增殖速度较快，但细胞传至9代后增殖速度减慢。

而MITCHELL等［14］对猪脐带WJ中的MSCs进行了研究，细胞传至80代时仍未呈现衰老趋势，也未表现出生长加速。

相关研究表明，脐带血管内皮经过消化获得的细胞呈贴壁生长，细胞培养24h后，可观察到2种形态的贴壁细胞：数量较多的鹅卵石样形态细胞，与血管内皮细胞相似；数量较少的纺锤状成纤维瘤样细胞，证实为MSCs的前体细胞。

脐带MSCs在体外培养体系中能快速增殖，传代后3~5d能增殖4~5倍，传代培养10代以上细胞可增加5~10倍，且增殖速度仍无明显降低，传代稳定，表明细胞增殖能力强。

2.2　免疫表型　大量研究表明从脐带分离所得的MSCs表面MHC-Ⅰ表达阳性，而MHC-Ⅱ阴性。

MSCs表达的MHC-Ⅱ有着极为重要的作用，因为其表达保护MSCs免受NK细胞对其造成杀伤。

MHC-Ⅱ可以引起NK或NK样细胞对于异物或肿瘤细胞杀伤作用的功能下调［15］。

MHC-Ⅱ的缺失使得MSCs逃避了同种异体CD4+T细胞的识别。

另外MSCs不表达共刺激分子CD40、CD40L、CD80或CD86，这些分子是效应性T细胞激活所必需的。

可见这些共刺激分子的缺无，使得T细胞活化的第二信号丧失，导致Th细胞的无反应性而促成免疫耐受。

同时，流式细胞仪检测显示，第3、5、10代细胞间免疫表型无明显差异，均强表达CD13、CD29、CD105、CD44，弱表达CD106，不表达CD14、CD34、CD1la、CD31、CD45及HLA-Ⅱ抗原，不表达或低表达HLA-Ⅰ抗原［16］及移植免疫排斥相关的表面标记CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L，表明细胞高表达MSCs相关的标记而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原及移植排斥相关的细胞表面标记，是一类免疫缺陷细胞。

总之，人脐带MSCs的生物学特性与骨髓MSCs非常相似，尤其是流式检测结果更是与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSCs免疫表型一致。

3　脐带MSCs的分化能力大量体外实验证明，在不同诱导条件下，间充质干细胞不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化。

NEVO等［17］以维生素C、地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导MSCs，细胞密度>1×106个/cm2，诱导后软骨细胞的比例达到85%。

ROMANOV等［12］将脐带血管内皮干细胞在2次传代后分别进行诱导：在脂肪培养基中培养2周后进行油红染色，几乎所有的细胞内均存在脂滴。

也有相关实验用含有1-甲基-3-丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、消炎痛的培养基诱导MSCs分化，结果分化的细胞内出现脂质空泡，并表达过氧化物酶增多活性受体r2（PPARr2）、脂多糖脂酶（LPL）和脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白Ap2，且诱导分化率达95%。

WOODBURY等［18］首次报道MSCs在特定条件下可分化为神经元样细胞，引起了巨大的轰动。

随后，国内外众多实验室分别对不同种属、不同来源的MSCs进行了大量的神经分化方面的体内外研究。

研究表明，大鼠、小鼠、人、兔等MSCs在特定的诱导条件下均可分化为神经元样细胞。

侯玲玲等［19］将2、5、8代的脐血间充质干细胞制备细胞爬片，诱导4、6、12h免疫组化检测细胞均有NSE和NF的表达。

JEONG等［20］对脐血诱导分化，得到表达神经元和神经胶质标志的细胞，在诱导24h后多数细胞态已经发生变化。

GOODWIN等［9］将4代的脐血间充质干细胞以bFGF、EGF 诱导7d后细胞形态发生明显变化，细胞免疫化学及Western blot均证实有细胞骨架蛋白β-tubulinⅢ、星形细胞胶质纤维酸性蛋白的表达。

生肌决定因子MyoD是一种肌细胞转录因子，调控成肌细胞的增殖和分化，被认为是肌细胞定向分化调控的主基因。

有研究［21］将脐血MSCs以马血清、地塞米松、氢化可的松诱导3d即有MyoD和Myo-genin的表达。

也有学者将形态及表面标志与人脐血MSCs相似的犬脐带血MSCs置于IMDM培养基，表达肌节性肌动蛋白和结蛋白［22］。

武开宏［23］研究在内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用下，UCDS细胞能否向内皮细胞方向分化。

实验表明，在体外经过诱导之后，细胞形态不断发生变化，形成网格样结构。

免疫荧光显示，分化后的UCDS细胞CD31、CD34染色阳性，具有摄取DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI -Ac-LDL）的功能。

流式鉴定细胞的分化效率可达50%左右。

下肢缺血动物模型也证明，UCDS细胞能够在体内缺血环境下分化为内皮细胞，并且参与血管新生，改善下肢缺血状况。

4　应用前景脐带MSCs目前已可稳定地在体外分离，且扩增迅速，由于其具有低免疫原性、支持造血及多向分化潜能的特点，它在多项医学组织工程方面具有广泛的临床应用前景。

张浪辉等［16］的研究表明人脐带MSCs对异源性脐带血T淋巴细胞激活和增殖具有非选择性及剂量依赖性的抑制作用；并且具有表达化学趋化因子及相关黏附分子的特性，有利于实现自身的归巢定位并引导造血干祖细胞的有效归巢与植入［24］。