脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脐带间充质干细胞
02 脐带间充质干细胞的应用 领域
医学研究
01
02
03
细胞分化研究
脐带间充质干细胞具有多 向分化能力，可以用于研 究细胞分化的机制和过程。
药物筛选
通过脐带间充质干细胞进 行药物筛选，可以更准确 地预测药物在人体内的效 果和安全性。
疾病模型建立
利用脐带间充质干细胞可 以建立各种疾病模型，为 疾病的研究和治疗提供有 力工具。
脐带间充质干细胞可以分化为心肌细胞 ，对于一些心血管疾病如心肌梗死、心 力衰竭等具有一定的治疗作用。
神经系统疾病治疗
脐带间充质干细胞可以分化为神经细胞， 对于一些神经系统疾病如帕金森病、阿尔 茨海默病等具有一定的治疗作用。
03 脐带间充质干细胞的研究 进展
基础研究进展
脐带间充质干细胞的分离和培养技术不断优化，使得细胞产量和活性得到提高。
透明度与公开性
加强脐带间充质干细胞研究与应用的 信息公开和透明度，避免信息不对称 和误导。
应对争议与挑战
积极应对脐带间充质干细胞研究与应 用中出现的争议和挑战，促进科技健 康发展和社会进步。
05 未来展望
技术发展前景
1 2 3
高效分离与扩增技术
随着科研技术的不断进步，未来脐带间充质干细 胞的分离和扩增技术将更加高效，提高细胞产量 和纯度，降低成本。
性得到验证。
针对特定疾病的脐带间充质干细 胞治疗方案不断优化，为临床应
用提供更多选择。
技术创新与突破
基因编辑技术的引入，使得脐 带间充质干细胞的遗传改造成 为可能，为疾病治疗提供定制 化解决方案。
微载体、微囊泡等新型细胞培 养技术的应用，提高了脐带间 充质干细胞的体外扩增效率和 活性。
开发出新型的脐带间充质干细 胞载体和注射方法，降低治疗 难度，提高治疗效果。
脐带间充质干细胞培养操作细则
脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
2.查看客户信息是否与交接表一致。
3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。
2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。
50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。
将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。
拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。
使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。
6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。
清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。
再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。
7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。
脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞新生儿脐带组织——脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
脐带间充质干细胞的特性：间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。
间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。
脐带间充质干细胞的分化能力：间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。
这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。
脐带间充质干细胞的取材：脐带间充质干细胞来源于新生儿脐带华通氏胶，取材方便，体外增殖能力强。
一根脐带提取的间充质干细胞的数量相当于成人5000毫升骨髓中的间充质干细胞数量，且质量优、活性高、更纯净，可多次使用，是理想的间充质干细胞来源。
脐带间充质干细胞的分离培养：1. 取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织。
2. 将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素。
3. 脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，4. 一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
间充质干细胞临床应用美国FDA已批准了近60项临床试验，主要包括以下几个方面：1）造血干细胞移植：增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入；治疗移植物抗宿主病。
2）组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。
3）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。
4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。
7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。
8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。
脐带msc原代收获标准
脐带msc原代收获标准一、啥是脐带MSC呀？咱先唠唠这个脐带MSC，它可是个挺神奇的东西呢。
MSC就是间充质干细胞啦，脐带里的这个间充质干细胞就像是一群超级小卫士。
它们有特别厉害的本事，可以分化成好多不同的细胞类型，就像孙悟空能七十二变似的。
而且啊，在医学研究和治疗领域那可有着大大的潜力哦。
二、收获的时机很重要呢。
说到这个脐带MSC原代收获的标准，收获时机那可不能马虎。
你想啊，如果太早去收获，就像摘没熟的果子，细胞可能还没发育好呢。
这时候的细胞可能数量不够，活力也不强。
那要是太晚呢，就好比果子熟透了掉地上烂了，细胞可能就开始出现各种问题啦，比如说它可能已经开始分化得乱七八糟，失去了我们想要的那种原始状态下的特性。
一般来说呀，要瞅准脐带刚采集下来不久这个黄金时期。
这个时候细胞的状态就像是刚睡醒的小娃娃，充满了活力，正等着我们去把它们好好地收集起来呢。
三、细胞数量得够格。
在收获的时候，细胞数量可是一个关键的考量因素。
咱们得确保收获到足够多的脐带MSC。
太少的话，就像你做饭的时候材料不够，那还咋大展厨艺呢？在科研或者治疗应用里，如果细胞数量不够，就达不到我们想要的效果啦。
那多少算够呢？这就得根据具体的研究或者治疗方案来定了，但是总得有个底线，不能少得可怜。
比如说在某些基础的细胞研究实验里，可能需要至少达到一定的细胞浓度，这样才能保证实验数据的准确性和可靠性。
四、细胞活力是关键。
除了数量，细胞活力那也是相当重要的。
细胞活力就像是人的精气神一样。
活力高的细胞，就像朝气蓬勃的年轻人，干啥都带劲。
我们收获的脐带MSC得是活力满满的那种。
怎么看活力呢？这就有很多小窍门啦。
可以通过一些专门的检测方法，看看细胞的代谢状态呀，细胞的形态是不是饱满呀之类的。
如果细胞一个个都蔫头耷脑的，那肯定是不行的。
就像你去挑水果，你肯定也不愿意要那些看着就没精神的吧。
五、细胞的纯度也要保证。
咱收获的脐带MSC得纯纯的才行。
不能混进去太多其他乱七八糟的细胞。
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理一、概述脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。
与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。
本文将就WJ-MSCs制备原理进行详细介绍。
二、脐带间充质干细胞的来源脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。
在脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。
这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。
三、WJ-MSCs制备方法1. 脐带获取制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。
通常情况下，在新生儿出生后不久即可进行采集。
采集过程中需要注意消毒和无菌操作。
2. 分离WJ组织将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ组织。
WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。
3. 制备单细胞悬液将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。
消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。
4. 培养和扩增将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。
在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。
5. 鉴定和纯化经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定和纯化。
通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。
6. 冻存经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。
在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。
四、WJ-MSCs的应用前景WJ-MSCs具有广泛的应用前景。
目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等。
脐带间充质干细胞外泌体在多种疾病治疗中的研究进展
随着外泌体研究的深入，科学家发现它是参与细胞间物质与信息传递的重要一环。
对外泌体的研究兴趣也日益增长，主要集中在疾病诊断和细胞治疗领域。
由于脐带间充质干细胞具备采集方便、增殖能力强和免疫原性低的优势，其分泌的外泌体常被用于再生医学和各种疾病的治疗研究。
外泌体，来源：Alxerion Biotech01脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。
由于其来源无伦理学限制，容易获得且增殖速度快，免疫原性低，目前已广泛应用于治疗缺血性疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤和自身免疫性疾病等临床研究中,是细胞治疗和再生医学的首选。
外泌体，来源：Direct Biologics02外泌体（exosome, EXO）外泌体（exosome, EXO）是由细胞分泌的直径为30～100nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。
近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。
外泌体治疗的主要优势体现在：免疫原性比细胞更低，内容物稳定易保存，可通过改变细胞环境调节外泌体功能，易于量产。
但是，应用也有一些难点：分离纯化方法的选择和优化，如何向靶细胞递送药物等。
在制备高质量、均匀、大量的外泌体以及优化外泌体储存条件时也存在挑战。
外泌体，来源：Beckman Coulter03脐带MSC-EXO的应用在与MSCs具有相同功能的同时，脐带MSC-EXO还拥有更显著的安全性。
而且采集方便、增殖能力强和免疫原性低的优势，已被广泛用于再生医学及各种疾病的治疗研究。
肾脏疾病研究者发现，脐带MSC-EXO在体外和体内，对抗癌化疗药物顺铂诱导的肾毒性都具有治疗作用。
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作为种子细胞，临床上主要用于 治疗机体无法自然修复的组织细 胞和器官损伤的多种难治性疾病
作为免疫调节细胞，治疗免疫排 斥和自身免疫性疾病
脐带间充质干细胞具有临床应用价值
• • 泌尿系统：肾实质的修复； • • 消化系统：肝组织的修复； • • 内分泌系统：胰岛细胞的修复； • • 神经系统：脑、脊髓损伤的修复； • • 血液系统：化疗、放疗后造血系统
样本接收标准
• 脐带的接收标准： 1.样本信息一致、无误，并能追溯至脐带所 有人。 2.母血采集量≥5ml 脐血检测样本采集量≥5ml 3. 采集套装内容完整，无缺失；采集信息 登记完整、字迹清楚易辨认。 4.无可能造成供者基因型异常的家族史。 5.供者健康调查表登记信息无异常。
间充质干细胞的制备方式
阴性
细胞发放
• 1.细胞的保存(基质：生理盐水或者保 存液）
• 2.运输要求：时间、温度 • 3.病人信息填写完整 • 4.样本检测合格
MSC治疗禁忌证：
• 1. 怀孕。
• 2. 精神病。
•
3. 3. 4.
严重的心、肝、肾、肺功能不全。 不合能并控其制 他的有严致重命感危染险。的疾病。
• 5>.6一5岁般）受。者年龄不超过65岁 （个别患者
华通氏胶的提取与培养 • 华通氏胶提取： • 1.消毒 • 2.清洗 • 3.分离出两条动脉和一条静脉 • 4.剥取华通氏胶 • 5.剪碎华通氏胶（大小1mm3 ） • 6.接种至培养皿培养（密度2-3g/10cm
皿）
间充质干细胞原代培养
• 细胞补液和换液（原代培养）
• 1. 制备五天补液（观察是否有细胞爬 出）
脐带——获取干细胞的另一来源
我国科学家2006年首次从新生婴儿废弃的
脐带组织中得到了一种多能干细胞，称 作脐带间充质干细胞(UC-MSC)。UCMSC具有胚胎干细胞类似的增殖能力和 多向分化潜能，且来源丰富、取材方便、 低病毒感染率、无伦理障碍，又没有胚 胎干细胞产生畸胎瘤的问题，并且抗原 性很低。不产生免疫排斥反应，异体使 用无需HLA配型。
• 2.八天换液
间充质干细胞的冻存
• 细胞收集前须给检测送样做细菌检测 和流式（CD90+、CD105+、CD166+）
• 冷冻保护剂（胎牛血清+DMSO） 配制：DMSO 10%
• 冷冻方式 深低温冰箱梯度降温
细胞治疗程序
1、治疗前咨询： 明确诊断，明确疾病处于哪一期；
2、治疗风险： 分析利弊；可能的副作用；获益
什么是脐带间充质干细胞？
• 脐带间充质干细胞 （Mesnchymal Stem Cells， MSCs）是指存在于新生儿脐带 组织中的一种多功能干细胞，它 能分化成许多种组织细胞。
间充质干细胞
间充质干细胞（ mesenchymal stem cells，
MSC）是干细胞家族的重要成员，来 源于发育早期的中胚层和外胚层。 MSC最初在骨髓中发现，因其具有多 向分化潜能、造血支持和促进干细胞 植入、免疫调控和自我复制等特点而 日益受到人们的关注。
的修复； • • 循环系统：心肌修复、血管修复； • • 免疫系统：调节免疫，移植治疗时可
降低免疫排斥反应； • • 衰竭器官的结构和功能的修复和再生：
最终替代组织和器官移植。
间充质干细胞治疗途径
• 腰穿途径 • 静脉途径 • 局部种植 • 介入途径
优势
• 1、取材方便：采集过程简单、无痛苦， 不影响母子健康；
• 6. 自体免疫性疾病晚期。
• 7. 恶性肿瘤。
• 8. HIV 阳性
案例分析
干细胞临床应用
一、肝硬化
细胞移植有可能成为肝硬化治疗的最
• 间充质干细胞的制备原理：
脐带华通氏胶内富含间充 质干细胞，通过分离获得华通 氏胶后，并进行体外培养，利 用间充质干细胞贴壁生长和可 体外扩增特性，可获得更多的 间充质干细胞。
组织块分 离法
免疫五项检测均为阴性
工艺流程简介
供者筛选 发放 运输
临床应用
采集 复苏
接收 冻存
制备 培养
信息反馈
间充质干细胞的制备方式
间充质干细胞治疗疾病的原理
• 替代和修复死亡和受损伤的细胞； • 激活休眠和处于抑制状态的细胞； • 旁分泌作用（分泌神经营养因子、抗
凋亡因子等）
涉及病症
肝脏疾 病
糖尿 病
神经系 统疾病
心血管 疾病
间充质
骨关
干细胞
节疾
病Leabharlann 烧伤血液系 统疾病
多向分化
是关键
鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、
能支持造血和促进造血干细胞植入、调
• 2、细胞数量丰富：增值能力强，可为组 织器官的修复和再生提供所需的大量细胞；
• 3、免疫原性低：具有独特的免疫调 节功 能，自体使用不引起免疫排斥反应，异体 移植还可降低免疫反应；
• 4、不涉及社会、伦理及法律方面的更多 争议。
前景
• 干细胞治疗是继药物治疗、手术治疗 之后的又一场医疗革命。目前，发达 国家已经开始将干细胞治疗技术用于 临床治疗自身免疫性疾病、心肌梗死、 脊髓损伤、心力衰竭等疾病。
间充质干细胞前景
干细胞的魅力在于：一旦身体需要，这
些细胞可按照发育途径通过分裂而产 生分化成熟的体细胞。也许在某一天， 人们突然发现，人体器官可以在实验 室按需要、按流程生产，血细胞、脑 细胞、骨骼、心肌细胞、肝脏、神经 等的更换都不成问题，即使患上白血 病、帕金森氏症和癌症这些不治之症 也能绝处逢生。
供者筛选
• 供者需要提供供者的既往病史、 现病史、家族史等资料。
样本采集运输要求
• 脐带采集标准： 1.脐带长度不得低于20cm 2.脐带两端均在2-3cm处结扎 3.脐带保存液在有效期内，并且无明显颜色变
化 4.脐带保存瓶无漏液现象，密封严实、无裂横 5.采集套装内容完整，无缺失 6.采集信息登记完整、字迹清楚易辨认 7.脐带运输时间在规定范围内 8.温度控制在适度范围内（0度-25度）
3、知情同意：
治疗前准备
• 1). 安全检测:菌检； • 2). 个体化治疗方案设计：每一位病
人的治疗方案，都根据其评价结果具 体制定; • 3). 需要的细胞数量； • 4). 细胞的使用方法； • 5). 可能出现的不良反应及应对措施。
间充质干细胞质量要求
• 细菌检测 • 内毒素检测 • 革兰氏检测 • 支原体检测 • 活性检测≥90%