AD转基因小鼠的鉴定
AD转基因小鼠的鉴定
转基因小鼠的鉴定、剪鼠尾1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2.分辨小鼠的年龄a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天；c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天；d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。
3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下：1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡混匀。
2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。
3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离。
、，I •、、+ :注意：1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。
4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。
5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。
AD小鼠模型介绍
AD小鼠模型介绍AD小鼠模型，即阿尔茨海默病小鼠模型，是一种用于研究阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的动物模型。
阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为认知功能障碍和记忆力丧失。
目前还没有有效的治疗方法，因此研究AD的机制和治疗方法变得至关重要。
AD小鼠模型是研究该疾病的重要工具之一AD小鼠模型通常通过基因工程技术构建，根据不同的基因突变或操纵来模拟AD发病机制和临床表现。
这些小鼠通常表现出与人类AD患者相似的一些病理特征，如神经元损伤、β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白磷酸化等。
通过对这些AD小鼠模型的研究，科学家可以更好地了解AD的发病机制，寻找新的治疗方法和药物靶点。
目前，AD小鼠模型已经被广泛应用于AD病理生理学研究、新药筛选和临床药物评估等领域。
下面将介绍一些常见的AD小鼠模型及其特点：1. APP/PS1双转基因小鼠：这是最常见的AD小鼠模型之一，它通过表达人类APP（β淀粉样前体蛋白）和PS1（presenilin-1）基因，模拟AD的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
这种模型通常表现出记忆力损失、神经退化等AD病理生理学特征。
2. 3xTg-AD小鼠：这是一种同时表达人类APP、PS1和tau蛋白P301L基因的三转基因小鼠。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出早期记忆障碍和晚期神经元损伤等表型。
3.Tg2576小鼠：这是一种表达人类APP基因的转基因小鼠模型。
该模型主要用于研究β淀粉样蛋白在AD发病中的作用，通常表现出大量的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
4. 5xFAD小鼠：这是一种表达人类APP、PS1和tau蛋白基因的五转基因小鼠模型。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出更加严重的神经元损伤和认知功能障碍等表型。
除了以上几种常见的AD小鼠模型外，还有许多其他基因操纵小鼠模型被用于AD的研究。
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略基因工程小鼠是研究基因功能和疾病机制的重要模型生物，它们通过基因工程技术进行特定基因的敲除、突变或过表达，从而模拟人类疾病的发生和发展过程。
然而，饲养和繁育基因工程小鼠以及对其进行鉴定是一个复杂而关键的过程。
本文将介绍基因工程小鼠饲养繁育及鉴定的策略。
一、基因工程小鼠饲养繁育策略1. 选择合适的饲养环境：基因工程小鼠对其饲养环境的要求较高，应提供适宜的温度、湿度和光照条件，以及清洁的饮水和饲料。
饲养箱应定期消毒，确保小鼠的健康生长。
2. 选择合适的饲料：基因工程小鼠的饲料应根据其基因改造的特点进行调整。
例如，敲除特定基因的小鼠可能需要特殊的饲料补充物来维持其生存和生长。
3. 繁殖管理：基因工程小鼠的繁殖需要进行严格的管理。
通常采用配对交配的方式进行繁殖，确保后代的基因遗传稳定。
此外，对于一些特殊基因型的小鼠，可能需要进行人工授精或胚胎移植等技术手段来实现繁殖。
4. 健康监测：定期对基因工程小鼠进行健康监测，包括体重、行为观察和疾病筛查等。
如发现异常情况，应及时采取相应的处理措施，以保证小鼠的健康状况。
二、基因工程小鼠鉴定策略1. 基因型鉴定：通过PCR、Southern blotting、Western blotting等技术来检测基因工程小鼠是否成功敲除、突变或过表达目标基因。
这些技术可以通过检测目标基因的DNA或蛋白质来确定小鼠的基因型。
2. 表型鉴定：基因工程小鼠的表型鉴定是评估其外部表现和生理特征的过程。
通过观察小鼠的行为、外貌、器官形态等方面的变化，可以初步判断基因改造对小鼠的影响。
3. 功能鉴定：基因工程小鼠的功能鉴定是评估其基因改造对生物学功能的影响。
可以利用行为学实验、生理学指标测定、组织学分析等技术手段来评估小鼠的功能变化，进一步揭示基因改造对生物过程的影响机制。
4. 遗传稳定性鉴定：基因工程小鼠的遗传稳定性鉴定是评估其基因改造是否稳定传递给后代的过程。
ad小鼠模型评价标准
ad小鼠模型评价标准
AD小鼠模型的评价标准主要包括以下几个方面：
1. 体重变化：观察小鼠体重的增长情况，可以间接反映模型的健康状况。
2. 皮肤病变：观察皮肤炎症等病变的情况，如红斑、水肿、鳞屑等，以及皮肤炎症的严重程度和范围。
3. 嗜酸性粒细胞浸润：检测皮肤中嗜酸性粒细胞的浸润情况，嗜酸性粒细胞在AD模型中通常会增加。
4. 血清总IgE浓度：检测血清中总IgE的浓度，IgE的升高通常与过敏反应有关，也是AD的重要特征之一。
5. 病理学分析：通过病理学分析，观察皮肤炎症、表皮增生、真皮血管增生等病理改变。
6. 行为学观察：观察小鼠的行为变化，如抓挠、舔舐等自发的搔痒行为，以及焦虑、抑郁等情绪变化。
综合以上几个方面的观察和检测结果，可以对AD小鼠模型进行评价。
AD小鼠模型介绍
AD动物模型分类 5. APP/PS1转基因AD小鼠模型
该模型以C57BL/6J小鼠为背景,转入了含有瑞典型(Swedish) 突变位点的APP基因(K595N/M596L),同时还含有第9个外显子删 除的PS1突变基因
APP/PS1双转基因AD小鼠模型在3月龄时出现学习和记忆缺 陷,6月龄时脑内可见明显的老年斑沉积,12月龄时可见大量的老年 斑形成,具有和AD相似的病理表型
宗园媛, 王晓映, 王海林,等. APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析 [J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(9):8-12.
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
通过将APPSwe和tauP 301L同时显微注射进PS1M 146V 基因敲入小鼠的单细胞胚胎中,得到了携带APPSwe, tauP 301L, PS1M 146V基因的三重转基因小鼠—3x Tg-AD小鼠
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
3x Tg-AD小鼠是目前最接近家族型阿尔茨海默病的动物模型, 它具有AD的主要神经病理学特征—SP和NFT,脑中出现神经元死 亡、突触丢失等AD的重要病理变化,且该转基因动物模型由于认 知障碍出现、病理发生较早,使得研究过程更加经济快速
祝艳秋, 张兰. 基于3xTg-拟阿尔茨海默病小鼠模型的药理学研究进展[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(2):61-66.
AD动物模型分类 3.腹腔注射东莨菪碱
东莨宕碱能选择性地阻断M受体，使突触后乙酰胆碱含 量变化，影响某些酶系变化，继而影响细胞内外钙离子含 量，导致神经细胞死亡，引起痴呆的病理生理变化。
董洪涛, 房繄恭. 多因素AD动物模型的建立及针刺对其学习记忆功能的影响[J]. 上海中医药杂 志, 2002, 36(5):43-46.
老年痴呆症(AD)小鼠模型的建立及中药金银花治疗效果的实验研究
能力降低；中药复方制剂通过排铝、提高抗氧化能力治疗后对老年痴呆症有明显疗效。
关键词：铝；老年痴呆症；乙酰胆碱酯酶；抗氧化能力
一、 引言
老年痴呆症（ ＡＤ） ，又称阿尔茨海默病，是一组病因未明
ｍｉｎｕｍ Ａｌ ３＋ ｉｎ ｍｉｃｅ （ ｘ±ｓ）
组别
谷丙转氨酶（ Ｕ ／ Ｌ）
脑铝 Ａｌ ３＋（ ｎｇ ／ ｍＬ）
正常组
４０．５８±２１．８２
１０９．００±２７．３３ ★★
５８．０６±２２．１１
模型组
治１组
１３．７０±２．３１
４４７．００±３７６．４３
６０．３３±１６．５０
治２组
１８５．７１±３１．５５
小鼠取脑，称脑重量，制成脑匀浆，离心取上清，分别测定脑中乙酰胆碱酯酶（ ＡｃｈＥ） 、超氧阴离子自由基（ ） 清除率、谷胱甘肽
等含量。 结果：正常组、模型组、治疗 １ 组、治疗 ２ 组依次为，脑乙酰胆碱酯酶（ ＡｃｈＥ） 活力：０．６０±０．０９、０．５５±０．１０、０．６７±０．１２、０．７８
±０．１４（ Ｕ ／ ｍｇ．ｐｒｏｔ ） ，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１ 差异有统计学意义；模型组明显降低；超氧阴离子自由基（ ） 清除率％ ：２１．４５±６．０１、７．９６±
综 述
按试剂盒说明书；清除率测定利用比色法。 铝含量，用电极
法测定；丙二醛测定，硫代巴比妥酸（ ＴＢＡ） 反应比色测定其
含量，因此又称（ ＴＢＡ） 法。 具体操作按试剂盒说明书。
（ 三） 统计学处理
·１７４·
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析杜丽莎;杨青【摘要】目的研究P糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)在APP/PS1双转基因阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠脑中的表达与功能情况.方法采用RT-PCR、real-time PCR和Western blot方法分析不同月龄的AD小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠脑中P gp表达的差异;采用尾静脉注射罗丹明123 (Rhodamine 123,Rh123),HPLC检测脑及血清中Rh123的含量,计算脑血分配系数,分析不同月龄的AD小鼠和WT小鼠脑中P gp功能的差异.结果 3月龄时,AD 小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显低于WT小鼠;6月龄时,AD小鼠与WT小鼠无明显差异;9月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显高于WT小鼠;12月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达高于WT小鼠,功能却低于WT小鼠.结论 AD小鼠脑内P-gp的表达与功能与WT小鼠明显不同,并随月龄而变化.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2014(041)004【总页数】6页(P441-446)【关键词】阿尔兹海默症(AD);P-糖蛋白(P-gp);APP/PS1双转基因小鼠;β淀粉样蛋白(Aβ)【作者】杜丽莎;杨青【作者单位】复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433;复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433【正文语种】中文【中图分类】R742.8+9;Q513阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，其发病机理复杂，目前尚无定论。
β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的产生与清除失衡导致Aβ大量沉积是AD主要病理特征之一，有效减少Aβ在脑中的沉积是被广泛探索的AD治疗途径之一[1-3]。
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是MDE1基因的表达产物，相对分子质量(Mr)为170 000。
阿尔兹海默症小鼠评价指标和实验方法
阿尔兹海默症小鼠评价指标和实验方法阿尔兹海默症（Alzheimer's Disease，AD）小鼠的常用评价指标和实验方法主要包括以下几种：1. 条件性恐惧实验：这是一种基于巴普洛夫的条件反射原理设计的实验，可用于评估小鼠对特定环境刺激的记忆能力。
实验中，小鼠被置于特定环境中，并给予一个声音信号作为条件刺激，紧接着给予电击作为非条件刺激。
小鼠在恐惧时会出现静止状态，即除了呼吸之外无其他任何活动的防御姿势。
随后在相同或不同的环境中测试小鼠静止状态的持续时间，以评估其条件恐惧程度和记忆能力。
该实验对于评估AD动物模型的焦虑状态和环境条件刺激记忆功能具有良好效果。
2. 放射状迷宫（八臂迷宫）实验：这是一种用于评估小鼠空间学习和记忆能力的实验方法。
在一个八臂迷宫中，小鼠需要通过探索各个臂来找到食物。
通过比较造模前后小鼠在迷宫中的表现，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
3. Morris水迷宫实验：这是一种评估小鼠学习和记忆能力的行为学实验。
在一个圆形水池中，小鼠需要寻找一个隐藏的平台以逃离水面。
通过记录小鼠寻找平台的时间和路径，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
4. 一般行为学观察：包括观察小鼠的精神状态、毛发、饮食以及开场行为（在新环境中的探究活动）等变化。
这些观察可以提供有关小鼠整体健康状况和行为表现的信息，有助于发现与AD相关的非认知行为变化。
5. 生物标志物检测：通过检测小鼠脑组织中淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白等生物标志物的含量和分布，可以评估AD的病理进展。
这些标志物在AD 患者脑中沉积形成老年斑和神经纤维缠结，导致神经元死亡和认知障碍。
检测这些标志物可以帮助了解AD模型小鼠的病理状态，并可作为药物筛选的指标之一。
6. 神经电生理检测：通过记录小鼠脑电波活动和神经元放电情况，可以评估其神经功能和信息处理能力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
转基因小鼠的鉴定
一、剪鼠尾
1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠
尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2.分辨小鼠的年龄
a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；
b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天；
c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；
d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；
e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；
f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。
3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法
二、从鼠尾中提取DNA
采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下：
1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL
Buffer GTT。
震荡混匀。
2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。
3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋
震荡，使样品均匀分离。
注意：
1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。
4.14000rpm 离心1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一
个新的灭过菌的离心管中。
5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振
荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。
6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能
加完溶液，可分多次转入。
10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000
rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000
rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。
9.12000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以
彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。
10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入
50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH 值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）离心前室温孵育5min可增加产量。
3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。
三、PCR
PCR程序设定：
1＝94.0℃for 5:00
2＝94.0℃for 1:00
3＝59.0℃for 0:50
4＝72.0℃for 1:00
5＝Goto 2 2times
6＝94℃for0:50
7＝58℃for 0:50
8＝72℃for 1:00
9＝Goto 6 2times
10＝94.0℃for 0:50
11＝56.0℃for 0:50
12＝72.0℃for 1:00
13＝Goto10 32times
14＝72.0℃for 10:00
15＝4.0℃for 5:00
16＝END
目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：
PCR反应的体系（12μl）：APP
Primer APP-1 1.3μl
Primer APP-2 1.3μl
ddH2O 2μl
mix（CW0682）6μl
DNA 1μl
PCR反应的体系（12μl）：PS1
Primer PS1-1 1.3μl
Primer PS1-2 1.3μl
内参-1 1μl
内参-2 1μl
mix（CW0682）6μl
DNA 1μl
先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。
引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol，使用前先用12000rpm 离心1min，加入10x μl ddH2O，涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100μM的母液，取10μl 的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入90μl，混匀后即可得到10μM的引物工作液。
四、电泳
1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11齿。
分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。
用1.5%的琼脂糖凝胶。
2．点样：12μl的DNA，Marker加5μl。
点样时注意逐个点样，不要点错，最好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。
Marker的选择依基因片段大小而定。
3．跑电泳：打开电源，150v电压，30min左右即可。
4．照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。
5．保存。