AD转基因小鼠的鉴定
AD小鼠模型介绍
AD小鼠模型介绍AD小鼠模型，即阿尔茨海默病小鼠模型，是一种用于研究阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的动物模型。
阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为认知功能障碍和记忆力丧失。
目前还没有有效的治疗方法，因此研究AD的机制和治疗方法变得至关重要。
AD小鼠模型是研究该疾病的重要工具之一AD小鼠模型通常通过基因工程技术构建，根据不同的基因突变或操纵来模拟AD发病机制和临床表现。
这些小鼠通常表现出与人类AD患者相似的一些病理特征，如神经元损伤、β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白磷酸化等。
通过对这些AD小鼠模型的研究，科学家可以更好地了解AD的发病机制，寻找新的治疗方法和药物靶点。
目前，AD小鼠模型已经被广泛应用于AD病理生理学研究、新药筛选和临床药物评估等领域。
下面将介绍一些常见的AD小鼠模型及其特点：1. APP/PS1双转基因小鼠：这是最常见的AD小鼠模型之一，它通过表达人类APP（β淀粉样前体蛋白）和PS1（presenilin-1）基因，模拟AD的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
这种模型通常表现出记忆力损失、神经退化等AD病理生理学特征。
2. 3xTg-AD小鼠：这是一种同时表达人类APP、PS1和tau蛋白P301L基因的三转基因小鼠。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出早期记忆障碍和晚期神经元损伤等表型。
3.Tg2576小鼠：这是一种表达人类APP基因的转基因小鼠模型。
该模型主要用于研究β淀粉样蛋白在AD发病中的作用，通常表现出大量的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
4. 5xFAD小鼠：这是一种表达人类APP、PS1和tau蛋白基因的五转基因小鼠模型。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出更加严重的神经元损伤和认知功能障碍等表型。
除了以上几种常见的AD小鼠模型外，还有许多其他基因操纵小鼠模型被用于AD的研究。
DNA片段大小对制备转基因小鼠整合效率的影响
【 关键词】 外源Ｄ Ａ 转基 因小鼠； Ｎ ； 整合
［ 中图分 类号】 ９ —３ ［ Ｑ ５３ 文献 标识码 ］ 【 Ａ 文章编 号］ ６ ４５ １（０ ２０ ． １ ６０ １ ７ —８ ７２ １）２０ ．４ １
一
１ 材 料 与方 法
１１ 试 剂 、仪 器 与材 料 ．
个典型 的转基 冈小 鼠表达 载体 的构建主 要包
孕 马血清 促 腺激 素（ＭＳ 天津 实验动 物 中心 Ｐ Ｇ）
生产 、人 绒毛 膜促 性腺 激素 （ＣＧ） ｈ 上海 生化 制 药』
括 启 动予 序 列 、 内含 子序 Ｙ（ 选） Ｏ备 、拟表 达 的 目的
取 同 目见栓 的受 体 鼠腹腔 注射 １ ％
戊 巴比妥 钠 生 理 盐水 溶 液 （ ． ｍｌｇ体 重 ） 醉 后 ， ０１ ／ 麻
基 因和 多聚 腺嘌 呤加 尾信 号四个 部分 Ｉ。不 同 的转 ６ ＿ 基 冈表 达 载 体 构 建 的 策 略 、方 法 和 构 件 的 结 构 、 大 小， 终决定 了提供 显微注 射 的整个 ＤＮ 最 Ａ样 品 的 片 段 长度 。显 微 注射 用 ＤＮＡ样 品应 该 是 高纯 度 、
［ 收稿 日期］ ０ １０ —０ ２ １ －５３ 【 作者 简介］ 池 骏（９ ２）男， １８一 ，
Ｅｍａ ：ｈ ｕ １ ８ １０ ＠ｈ ｔ ｉｃ ｒ — ｉ ｃ ｉ ｎ ９ ２ ０ ８ ｏｍａｌｏ ｌ ｊ ．ｎ
生产 ： ２ Ｍ 、Ｍ １ 胎培 养 液 ，透 明质酸 酶 及矿 物 ６胚
油 购 自 Ｓｉ ｍａ公 刊 。体 视 显 微 镜 、 倒 置 显 微 镜 ｇ Ｏ ｙ ｕ 公司产 品： ｌｍｐ ｓ 显微 注射 系统及 制针 设备购 自Ｕ 本 Ｎａｉ ｉ 公 司： 胎培 养器皿 Ｆ ｌ ｎ３ ３ 、３ ０ ； ｒ ｈｇ ｓ ｅ 胚 ａｃ ０ ７ ０ ３ ｏ 原 核 注 射 针 、 持 卵针 、 胚 胎 移 植 针 、注 射 ＥＳ细 胞 针 等 自制 。
转基因小鼠安全评估
转基因小鼠安全评估
转基因小鼠是指经过人为基因改造的小鼠，通过插入外源基因来改变其遗传性状。
在进行转基因小鼠的安全评估时，需要对以下几个方面进行考虑：
1. 基因插入点的稳定性：转基因小鼠需要确认基因插入点是否稳定，避免插入点导致其他遗传变化或异常表达。
2. 基因导入的效率和选择性：确定基因导入的效率和选择性，要保证转基因小鼠中目标基因的表达水平和模式与预期一致。
3. 对小鼠生理和行为特征的影响评估：进行转基因小鼠的生理和行为特征的全面评估，比较其与野生型小鼠的差异，确保转基因过程没有引起明显的异常。
4. 对小鼠健康状况的评估：进行转基因小鼠的健康状况的评估，包括常规的血液学、生化学、组织学等指标的检测。
5. 长期观察评估：对转基因小鼠进行长期观察，了解其寿命、生殖能力、疾病发生率等方面的变化。
如果有异常，需要进一步研究其与转基因过程的关联性。
6. 繁殖和传代评估：对转基因小鼠的繁殖能力和后代的遗传特征进行评估，确保基因改造的稳定性和传代的可靠性。
总之，转基因小鼠的安全评估是一个复杂的过程，需要综合考虑基因插入的稳定性、对生理和行为特征的影响、对健康状况
的评估等多个方面。
这些评估结果将有助于确定转基因小鼠的安全性和可靠性，为进一步的研究提供基础。
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略基因工程小鼠是研究基因功能和疾病机制的重要模型生物，它们通过基因工程技术进行特定基因的敲除、突变或过表达，从而模拟人类疾病的发生和发展过程。
然而，饲养和繁育基因工程小鼠以及对其进行鉴定是一个复杂而关键的过程。
本文将介绍基因工程小鼠饲养繁育及鉴定的策略。
一、基因工程小鼠饲养繁育策略1. 选择合适的饲养环境：基因工程小鼠对其饲养环境的要求较高，应提供适宜的温度、湿度和光照条件，以及清洁的饮水和饲料。
饲养箱应定期消毒，确保小鼠的健康生长。
2. 选择合适的饲料：基因工程小鼠的饲料应根据其基因改造的特点进行调整。
例如，敲除特定基因的小鼠可能需要特殊的饲料补充物来维持其生存和生长。
3. 繁殖管理：基因工程小鼠的繁殖需要进行严格的管理。
通常采用配对交配的方式进行繁殖，确保后代的基因遗传稳定。
此外，对于一些特殊基因型的小鼠，可能需要进行人工授精或胚胎移植等技术手段来实现繁殖。
4. 健康监测：定期对基因工程小鼠进行健康监测，包括体重、行为观察和疾病筛查等。
如发现异常情况，应及时采取相应的处理措施，以保证小鼠的健康状况。
二、基因工程小鼠鉴定策略1. 基因型鉴定：通过PCR、Southern blotting、Western blotting等技术来检测基因工程小鼠是否成功敲除、突变或过表达目标基因。
这些技术可以通过检测目标基因的DNA或蛋白质来确定小鼠的基因型。
2. 表型鉴定：基因工程小鼠的表型鉴定是评估其外部表现和生理特征的过程。
通过观察小鼠的行为、外貌、器官形态等方面的变化，可以初步判断基因改造对小鼠的影响。
3. 功能鉴定：基因工程小鼠的功能鉴定是评估其基因改造对生物学功能的影响。
可以利用行为学实验、生理学指标测定、组织学分析等技术手段来评估小鼠的功能变化，进一步揭示基因改造对生物过程的影响机制。
4. 遗传稳定性鉴定：基因工程小鼠的遗传稳定性鉴定是评估其基因改造是否稳定传递给后代的过程。
ad小鼠模型评价标准
ad小鼠模型评价标准
AD小鼠模型的评价标准主要包括以下几个方面：
1. 体重变化：观察小鼠体重的增长情况，可以间接反映模型的健康状况。
2. 皮肤病变：观察皮肤炎症等病变的情况，如红斑、水肿、鳞屑等，以及皮肤炎症的严重程度和范围。
3. 嗜酸性粒细胞浸润：检测皮肤中嗜酸性粒细胞的浸润情况，嗜酸性粒细胞在AD模型中通常会增加。
4. 血清总IgE浓度：检测血清中总IgE的浓度，IgE的升高通常与过敏反应有关，也是AD的重要特征之一。
5. 病理学分析：通过病理学分析，观察皮肤炎症、表皮增生、真皮血管增生等病理改变。
6. 行为学观察：观察小鼠的行为变化，如抓挠、舔舐等自发的搔痒行为，以及焦虑、抑郁等情绪变化。
综合以上几个方面的观察和检测结果，可以对AD小鼠模型进行评价。
AD小鼠模型介绍
AD动物模型分类 5. APP/PS1转基因AD小鼠模型
该模型以C57BL/6J小鼠为背景,转入了含有瑞典型(Swedish) 突变位点的APP基因(K595N/M596L),同时还含有第9个外显子删 除的PS1突变基因
APP/PS1双转基因AD小鼠模型在3月龄时出现学习和记忆缺 陷,6月龄时脑内可见明显的老年斑沉积,12月龄时可见大量的老年 斑形成,具有和AD相似的病理表型
宗园媛, 王晓映, 王海林,等. APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析 [J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(9):8-12.
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
通过将APPSwe和tauP 301L同时显微注射进PS1M 146V 基因敲入小鼠的单细胞胚胎中,得到了携带APPSwe, tauP 301L, PS1M 146V基因的三重转基因小鼠—3x Tg-AD小鼠
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
3x Tg-AD小鼠是目前最接近家族型阿尔茨海默病的动物模型, 它具有AD的主要神经病理学特征—SP和NFT,脑中出现神经元死 亡、突触丢失等AD的重要病理变化,且该转基因动物模型由于认 知障碍出现、病理发生较早,使得研究过程更加经济快速
祝艳秋, 张兰. 基于3xTg-拟阿尔茨海默病小鼠模型的药理学研究进展[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(2):61-66.
AD动物模型分类 3.腹腔注射东莨菪碱
东莨宕碱能选择性地阻断M受体，使突触后乙酰胆碱含 量变化，影响某些酶系变化，继而影响细胞内外钙离子含 量，导致神经细胞死亡，引起痴呆的病理生理变化。
董洪涛, 房繄恭. 多因素AD动物模型的建立及针刺对其学习记忆功能的影响[J]. 上海中医药杂 志, 2002, 36(5):43-46.
转基因小鼠和显微注射以及验证
转基因小鼠和显微注射以及验证目录转基因小鼠制备实验方法 (2)Southern Blot原理及实验方法 (4)Northern Blot原理及实验方法 (6)RFLP标记 (12)1.点的多态性 (13)2.序列多态性 (14)显微注射实验操作 (14)转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析杜丽莎;杨青【摘要】目的研究P糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)在APP/PS1双转基因阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠脑中的表达与功能情况.方法采用RT-PCR、real-time PCR和Western blot方法分析不同月龄的AD小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠脑中P gp表达的差异;采用尾静脉注射罗丹明123 (Rhodamine 123,Rh123),HPLC检测脑及血清中Rh123的含量,计算脑血分配系数,分析不同月龄的AD小鼠和WT小鼠脑中P gp功能的差异.结果 3月龄时,AD 小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显低于WT小鼠;6月龄时,AD小鼠与WT小鼠无明显差异;9月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显高于WT小鼠;12月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达高于WT小鼠,功能却低于WT小鼠.结论 AD小鼠脑内P-gp的表达与功能与WT小鼠明显不同,并随月龄而变化.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2014(041)004【总页数】6页(P441-446)【关键词】阿尔兹海默症(AD);P-糖蛋白(P-gp);APP/PS1双转基因小鼠;β淀粉样蛋白(Aβ)【作者】杜丽莎;杨青【作者单位】复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433;复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433【正文语种】中文【中图分类】R742.8+9;Q513阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，其发病机理复杂，目前尚无定论。
β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的产生与清除失衡导致Aβ大量沉积是AD主要病理特征之一，有效减少Aβ在脑中的沉积是被广泛探索的AD治疗途径之一[1-3]。
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是MDE1基因的表达产物，相对分子质量(Mr)为170 000。
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转基因小鼠的鉴定
、剪鼠尾
1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾
剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2.分辨小鼠的年龄
a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；
b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天；
c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天；
d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；
e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；
f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。
3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法
、从鼠尾中提取DNA
采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下：
1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡
混匀。
2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。
3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,
使样品均匀分离。
、，I •、、+ :
注意：
1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。
4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌
的离心管中。
5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混
匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。
6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可
分多次转入。
10000rpm离心1mi n,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm
离心1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中
8.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm
离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
如需进一步提高DNA 纯度，可重复步骤8。
9.12000rpm 离心2min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCF等）。
10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200
卩I Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集DNA 溶液，-20 C保存DNA
1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）离心前室温孵育5min 可增加产量。
3）用另外的50-200卩L Buffer GE 或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4）如果需要提高DNA勺终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10;若洗脱体积小于200卩L,可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产
量。
PCR
PCR程序设定：
1 = 94.0 C for 5:00 2=94.0 C for 1:00
3= 59.0 C for 0:50
4= 72.0 C for 1:00
5= Goto 2 2times
6= 94 C for0:50
7= 58C for 0:50
8= 72C for 1:00
9= Goto 6 2times
10= 94.0 C for 0:50
11=56.0C for 0:50
12= 72.0 C for 1:00
13= Goto10 32times
14= 72.0 C for 10:00
15= 4.0 °C for 5:00
16= END
目前实验室的双转基因小鼠 AD 体系采用:
PCF 反应的体系（
12卩I ）: APP Primer APP-1 1.3 卩 I Primer APP-2 1.3 卩 l ddHO 2 卩 l mix (CW068) 6 卩 l DNA 1卩1 PS1 Primer PS1-1 1.3 卩 l Primer PS1-2 1.3 卩 l 内参-1 1 卩l 内参-2 1 ixl mix (CW068) 6 卩 l DNA PCF 反应的体系（
12卩I ）
: 卩1
先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq 酶混合均匀，最后再在各PCF管中依次加入DNA羊品。
引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol , 使用前先用12000rpm离心1min，加入10x卩l ddH 2O,涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100卩M的母液，取10卩l的母液，用ddHO稀释10倍，即加入90卩l，混匀后即可得到10卩M的引物工作液。
四、电泳
1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11 齿。
分别用的
0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。
用1.5%的琼脂糖凝胶。
2.点样：12卩l的DNA Marker加5卩l。
点样时注意逐个点样，不要点错，最好
把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。
Marker的选择依基因片段大小而定。
3.跑电泳：打开电源，150v 电压，30min 左右即可。
4.照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。
5.保存。