转基因小鼠鉴定实验
转基因小鼠的鉴定
转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周耳朵已经长开时剪鼠尾较好,此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强;2.分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时,此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶腹部有一小团白色物质,此小鼠出生2~3天；c当小鼠背部长出皮毛时,此小鼠出生3~4天；d当小鼠毛长全,但眼未开时,此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开,耳未开时,此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时,此小鼠出生14天左右;3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒康为世纪：cw2094提取DNA,操作如下：1.剪取小鼠长度为的尾巴,放入灭菌后的离心管中,加入180μL Buffer GTT;震荡混匀;2.加入20μL proteinase K,涡旋震荡,彻底混匀;3.置于56℃水浴,直到组织溶液完全清澈,一般需消化6-8h,赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离;注意：1 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质,必要时过夜消化再加入20μl proteinaseK消化,不会影响后续操作;2 如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液,震荡混匀,室温放置5-10min;4.14000rpm 离心 1min,以消除未消化的类似于鼠毛等组织,将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中;5.加入200μl Buffer GL,涡旋震荡,充分混匀,加入200μl 无水乙醇,涡旋振荡,充分混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;注意：1加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀;2 如果多个样品一起操作,Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品;3加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续操作;6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若以此不能加完溶液,可分多次转入;10000rpm 离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤8;9.12000rpm 离心 2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干;注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应酶切,PCR等;10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水,室温放置2-5min,10000rpm 离心 1min,收集DNA溶液,-20℃保存DNA;注意：1如果下游实验对PH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱,洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响,若用水作洗脱液应保证其PH值在直接,PH值低于时洗脱效率不高;2离心前室温孵育5min可增加产量;3用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量;4如果需要提高DNA的终浓度,可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上,重复步骤10；若洗脱体积小于200μL,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量;三、PCRPCR程序设定：1＝ 94.0℃ for 5:00 2＝ 94.0℃ for 1:00 3＝ 59.0℃ for 0:50 4＝ 72.0℃ for 1:00 5＝ Goto 2 2times6＝ 94℃ for0:507＝ 58℃ for 0:508＝72℃ for 1:009＝Goto 6 2times10＝ 94.0℃ for 0:50 11＝56.0℃ for 0:50 12＝ 72.0℃ for 1:00 13＝ Goto10 32times 14＝ 72.0℃ for 10:00 15＝ 4.0℃ for 5:00 16＝END目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：PCR反应的体系12μl：APPPrimer APP-1 μlPrimer APP-2 μlO 2μlddH2mixCW0682 6μlDNA 1μlPCR反应的体系12μl：PS1Primer PS1-1 μlPrimer PS1-2 μl内参-1 1μl内参-2 1μlmixCW06826μlDNA 1μl先在的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中一般多加两小管的量,将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次尽量避免产生气泡以便Taq酶混合均匀,最后再在各PCR管中依次加入DNA样品;引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后,EP管上会有标记,一般为x nmol,使用O,涡旋振动混匀,微型离心机离心,即可得前先用12000rpm 离心 1min,加入10x μl ddH2O稀释10倍,即加入90μl,混匀后即可得到到100μM的母液,取10μl 的母液,用ddH210μM的引物工作液;四、电泳1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种,分别用的梳子为50、25、11齿;分别用的TBE的量为90ml、45ml、25ml;用%的琼脂糖凝胶;2．点样：12μl的DNA,Marker加5μl;点样时注意逐个点样,不要点错,最好把中间的那个孔留着点Marker,这样可避免点样的出错;Marker的选择依基因片段大小而定;3．跑电泳：打开电源,150v电压,30min左右即可;4．照胶：看是否有目的条带,即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子;5．保存;。
《蛛丝蛋白八聚体转基因小鼠的制备及检测》范文
《蛛丝蛋白八聚体转基因小鼠的制备及检测》篇一一、引言随着现代生物医学的不断发展，转基因动物作为一种新型的实验动物模型在科学研究中的应用日益广泛。
转基因小鼠，尤其以其优异的实验特性成为研究者们经常选用的实验对象。
在众多研究领域中，关于蛛丝蛋白的研究更是令人瞩目。
而将蛛丝蛋白八聚体通过基因工程手段导入小鼠体内，并成功制备出转基因小鼠，为进一步研究蛛丝蛋白的功能及其在生物医学领域的应用提供了重要基础。
本文将详细介绍蛛丝蛋白八聚体转基因小鼠的制备过程及检测方法。
二、材料与方法（一）材料1. 蛛丝蛋白八聚体基因：经过基因克隆和修饰，用于转基因实验。
2. 小鼠受精卵：作为转基因的载体。
3. 显微操作设备：用于显微操作受精卵。
4. 转基因小鼠饲养设备及饲料：用于转基因小鼠的饲养和观察。
（二）方法1. 基因构建与修饰：对蛛丝蛋白八聚体基因进行必要的修饰，以适应小鼠基因组。
2. 显微注射：将修饰后的基因注射到小鼠受精卵中。
3. 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到代孕母鼠体内。
4. 转基因小鼠筛选：通过PCR、Southern Blot等方法检测转基因小鼠。
5. 转基因小鼠饲养与观察：对成功制备的转基因小鼠进行饲养和观察，记录其生长、发育等数据。
三、制备过程1. 基因构建与修饰：根据蛛丝蛋白八聚体的序列，设计引物并扩增出目的基因片段，然后进行基因修饰，使其适应小鼠基因组。
2. 显微注射：将修饰后的基因片段注射到小鼠受精卵中，使基因整合到小鼠基因组中。
3. 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到代孕母鼠体内，待其发育成转基因小鼠。
4. 转基因小鼠筛选：通过PCR、Southern Blot等方法检测整合了蛛丝蛋白八聚体基因的小鼠。
筛选出的转基因小鼠具有较高的纯度和特异性。
四、检测方法（一）PCR检测利用PCR技术对转基因小鼠进行基因型鉴定，以确定是否成功整合了蛛丝蛋白八聚体基因。
通过扩增目的基因片段并对其产物进行电泳分析，可观察到清晰的条带，从而判断出是否为阳性小鼠。
动物转基因细胞鉴定实验报告
动物转基因细胞鉴定实验报告实验目的：通过转基因细胞鉴定实验，判断某个动物体内是否存在外源DNA，并确定外源DNA的存在形式（整段或片段）及数量。
实验材料：1. 转基因动物组织样本（例如转基因小鼠的皮肤组织）；2. 免疫材料（例如抗体）；3. 实验所需试剂、设备（例如离心机、PCR设备）。
实验步骤：1. 提取转基因动物组织样本的细胞DNA。
可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取，按照盒内说明书的步骤进行操作。
2. 利用PCR技术对提取到的细胞DNA进行放大。
选择与外源DNA序列互补的引物，设置PCR反应体系，进行PCR扩增。
PCR扩增条件根据引物的具体要求来设置。
3. 将PCR扩增产物进行电泳分析。
将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载至琼脂糖凝胶中，接通电源进行电泳。
根据PCR产物的大小，判断是否存在特定长度的 DNA片段，进而得出外源DNA的存在与否。
4. 如有必要，对PCR扩增产物进行进一步的鉴定。
可以利用核酸杂交技术或DNA测序技术，确认扩增产物是否与外源DNA完全匹配。
结果与讨论：根据电泳结果，如果样品在特定长度处出现明显的DNA条带，并且与分子量标准品相匹配，可推断该动物体内存在特定长度的外源DNA片段。
如在其他长度处也观察到DNA条带，可能表示存在其他长度的外源DNA片段或非特异扩增产物。
如果在所有长度处都没有明显的DNA条带出现，说明该动物体内不存在外源DNA。
实验中还需要注意避免污染和假阳性结果的产生，可以采取一系列控制措施，如设立阴性对照、正常动物组织样品对照等。
结论：通过转基因细胞鉴定实验，可以初步判断某个动物体内是否存在外源DNA，并确定外源DNA的存在形式及数量。
这种实验方法在转基因动物监测和转基因动物研究中具有重要的应用价值。
ELISA检测小鼠Cre实验报告
ELISA检测小鼠Cre实验报告本研究采用原核显微注射方法制备受Cre重组酶调控表达的、非免疫耐受的卵清蛋白-HBsAg转基因小鼠，以期为乙肝防治提供更好的动物模型。
试剂及仪器携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠。
在目的基因OVA-HBsAg上游加入CMv增强子及鸡β -actin启动子，并加入两个同向的LoxP位点，以实现后续Cre酶对其表达的调控(图1A)。
目的基因构建成功后，连接入pCCALL2表达质粒(图1B)。
KSOM小鼠胚胎培养基购自Millipore发育良好的CS7BL/6J×DBA母鼠，腹腔注射PMSG10U，48h 后注射HCG 10U促排卵，与CS7BL/6J公鼠按1：1合笼，次日清晨检阴栓阳性有文八体鼠。
取受精卵置于KSOM培养基于37℃培养sh，在显微注射仪上将经内切酶Apa Ⅰ作用线性化的pCCALL-Anton注射入受精卵雄性原核内。
取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待其怀孕产仔后，进行检测。
转基因小鼠的鉴定剪取约1cm长鼠尾下游引物： 5'-GATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGT-3'。
反应条件： 94℃Smin； 94℃ 30s、s2℃ 30s、72℃40s，35个循环；72℃ 5min。
扩增片段318bp。
1.2.3OVA-HBsA转基因小鼠的繁育、传代扩群为尽快扩群,并使子代小鼠背景趋于一以,OvA-HBsAg转基因小鼠首建鼠建成后，与CS7BL/6J小鼠杂交进行传代、培育。
对所得子代小鼠进行PCR 鉴定，并用ELISA法检测HBsAg表达[检测波长450nm，参比波长630nm，吸光度(A)值>0.10s为阳性]。
PCR条件如1.2.2所述。
对PCR阳性鼠，于眼眶后静脉丛采血300u，37℃放置2h后，3000r/min离心10min,取上清，采用ELISA方法检测HBsAg表达。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，转基因动物模型在生物学、医学等领域的应用越来越广泛。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的生长因子，对血管生成具有促进作用。
VEGF164是VEGF家族中的一种亚型，具有较高的生物活性。
本文旨在介绍利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠的方法，并对其检测进行详细阐述，以期为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用C57BL/6J小鼠作为转基因实验动物。
（2）质粒：含有VEGF164基因的质粒。
（3）显微操作设备：显微操作仪、显微注射针、显微操作台等。
2. 方法（1）构建转基因载体：将VEGF164基因克隆到适当载体上，构建转基因载体。
（2）显微注射：将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
（4）繁殖与鉴定：将阳性小鼠进行繁殖，并对后代进行基因型鉴定和表达检测。
三、原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠1. 转基因载体的构建首先，将VEGF164基因克隆到适当的载体上，构建转基因载体。
这一步骤需要使用分子生物学技术，如PCR、酶切、连接等。
2. 显微注射将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
这一步骤需要在显微操作仪的辅助下进行，注射针需要精确地定位到受精卵的原核中，将转基因载体注入其中。
3. 筛选阳性小鼠通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
这一步骤需要对注射后的小鼠进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增和检测，以确定是否成功地将VEGF164基因整合到小鼠基因组中。
四、VEGF164转基因小鼠的检测1. 基因型鉴定对繁殖出的后代进行基因型鉴定，确定其是否为转基因阳性小鼠。
这一步骤同样需要进行PCR扩增和检测。
2. 表达检测对转基因阳性小鼠进行表达检测，以确定VEGF164基因在小鼠体内的表达情况。
转基因小鼠的检测
转基因小鼠的检测一、实验材料：小鼠、BSA、10*PCR缓冲液、蛋白酶K、dNTP溶液、引物、Taq酶、TE、marker二、实验药品准备1、尾缓冲液100ml （称取TRIS 0.6055g EDTA 3.722g Nacl 0.5844g SDS1g 定容至差不多100ml 然后用Hcl 调PH至8.0）2、10*PCR缓冲液10ml (称取Kcl 0.3727g tris 0.2422 Mgcl2 BSA0.5ml 定容至10ml,用Hcl调PH8.4)3、6mol\L Nacl 10ml (称取Nacl 3.506g 容于10ml 水中)4、70%乙醇10ml (量取95%乙醇7.37ml加水到10ml)需要灭菌的：尾缓冲液 1.5ml离心管PCR管、大枪头小枪头三、实验步骤1、切小鼠尾巴1cm ,置于有750ul尾缓冲液的1.5ml离心管中，再补加40ul蛋白酶K，55°温育过夜2、在振动器上剧烈混合2min3、加入250ul 6mol\L Nacl 在振动器上搅拌2min4、在离心机上室温离心5—10min5、取750ul上清液于新的1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇6、振动器上混合2min 离心机上离心1min7、弃上清，用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物3次8、乙醇挥发后用200ul TE 溶解9、取5ul进行PCR10、建立PCR体系：100ul95℃ 5min——94℃ 30sec---50℃ 30sec----73℃ 30sec---72℃ 5min---4℃保存30 cycle11、取PCR产物10ul 用1%凝胶电泳120V 30min12、观察条带。
小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的飞速发展，基因编辑技术为科研和医学应用带来了前所未有的机遇。
其中，原核显微注射技术作为基因编辑的一种重要手段，广泛应用于转基因动物模型的制备。
本篇论文将详细介绍如何利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠，并对其检测方法进行探讨。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用适宜的野生型小鼠作为实验对象。
（2）质粒：含有VEGF164基因的质粒。
（3）显微操作设备：显微操作仪、显微注射针等。
（4）培养基、试剂及其他辅助材料。
2. 方法（1）构建含有VEGF164基因的质粒。
（2）显微操作仪下，对野生型小鼠进行显微操作，制备受精卵或胚胎。
（3）将构建好的质粒注射到受精卵或胚胎的原核中。
（4）将注射后的受精卵或胚胎移植回代孕母鼠体内，使其发育成转基因小鼠。
（5）对转基因小鼠进行检测，包括基因型鉴定、表达水平检测等。
三、VEGF164转基因小鼠的制备1. 质粒构建首先，通过分子生物学手段构建含有VEGF164基因的质粒。
该质粒应具备在宿主细胞中稳定表达VEGF164基因的能力。
2. 显微操作与注射在显微操作仪下，对野生型小鼠的受精卵或胚胎进行操作。
利用显微注射针将构建好的质粒注射到受精卵或胚胎的原核中。
此过程需要精细的操作技巧和严格的实验条件。
3. 移植与发育将注射后的受精卵或胚胎移植回代孕母鼠体内，使其发育成转基因小鼠。
在此过程中，需要注意母鼠的营养和饲养环境，以确保其正常发育。
四、转基因小鼠的检测1. 基因型鉴定通过对转基因小鼠的基因组进行PCR、Southern Blot等分子生物学手段，鉴定其基因型，确认是否成功转入VEGF164基因。
2. 表达水平检测通过Western Blot、荧光定量PCR等手段，检测转基因小鼠中VEGF164基因的表达水平。
此外，还可通过观察转基因小鼠的表型变化，初步评估VEGF164基因的功能。
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转基因小鼠鉴定实验
在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。
因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。
1．转基因整合检测
鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。
检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。
（1）基因组DNA的提取：
1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。
（2） PCR检测：转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。
该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。
由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。
因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。
假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。
PCR 实验应采用双复管，甚至三复管。
阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。
（3） Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。
Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。
2．转基因表达检测
转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。
而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。
其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。