小鼠基因型鉴定报告
PCR法鉴定RorcγtGFP突变小鼠子代基因型
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Objective Methods Results Conclusion To investigate the feasibility of PCR in the genotype identification of Rorc t mutation mouse offspring.The genome DNA was extracted from the tails of six newborn mice produced by a male Rorc t(-/-)mouse and a female Rorc t(-/+)mouse.Rorc t gene fragments were amplified by PCR and then detected by agarose gel electrophoresis.Three mice had Rorc t(-/-)genotype with 241bp gene fragment,while three mice possessed Rorc t (-/+)genotype with 174bp and 241bp gene fragments.PCR-based method is simple and feasible for the genotype identification of Rorc t mutation mouse offspring.mouse;orphan receptor;genotype;PCR???????GFP GFP PCR Rorc t 法鉴定突变小鼠子代?GFP 基因型陈嵘，阿彩岭，周英，樊翌明祎（广东医学院附属医院皮肤科，广东湛江）524001ＰＣＲ－ｂａｓｅｄｇｅｎｏｔｙｐｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｌｉａｌｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＲｏｒｃｔｍｕｔａｔｉｏｎｍｉｃｅ?ＧＦＰCHEN Rong-yi,E Cai-ling,ZHOU Ying,FAN Yi-ming (Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China)摘 要：关键词：中图分类号：文献标识码：文章编号：目的方法结果结论ＤＯＩ：PCR()Rorc t Rorc t(-/-)Rorc t(-/+)6DNA PCR PCR 3PCR 241bp Rorc t(-/-)3174bp 241bp Rorc t(-/+)PCR Rorc tR 394.1A 1005-4057(2012)05-0477-06-0603-0310.3969/j.issn.1005-4057.2012.06.003探讨聚合酶链式反应法鉴定突变小鼠子代基因型的可行性。
转基因小鼠的鉴定
转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周耳朵已经长开时剪鼠尾较好,此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强;2.分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时,此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶腹部有一小团白色物质,此小鼠出生2~3天；c当小鼠背部长出皮毛时,此小鼠出生3~4天；d当小鼠毛长全,但眼未开时,此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开,耳未开时,此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时,此小鼠出生14天左右;3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒康为世纪：cw2094提取DNA,操作如下：1.剪取小鼠长度为的尾巴,放入灭菌后的离心管中,加入180μL Buffer GTT;震荡混匀;2.加入20μL proteinase K,涡旋震荡,彻底混匀;3.置于56℃水浴,直到组织溶液完全清澈,一般需消化6-8h,赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离;注意：1 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质,必要时过夜消化再加入20μl proteinaseK消化,不会影响后续操作;2 如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液,震荡混匀,室温放置5-10min;4.14000rpm 离心 1min,以消除未消化的类似于鼠毛等组织,将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中;5.加入200μl Buffer GL,涡旋震荡,充分混匀,加入200μl 无水乙醇,涡旋振荡,充分混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;注意：1加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀;2 如果多个样品一起操作,Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品;3加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续操作;6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若以此不能加完溶液,可分多次转入;10000rpm 离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤8;9.12000rpm 离心 2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干;注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应酶切,PCR等;10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水,室温放置2-5min,10000rpm 离心 1min,收集DNA溶液,-20℃保存DNA;注意：1如果下游实验对PH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱,洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响,若用水作洗脱液应保证其PH值在直接,PH值低于时洗脱效率不高;2离心前室温孵育5min可增加产量;3用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量;4如果需要提高DNA的终浓度,可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上,重复步骤10；若洗脱体积小于200μL,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量;三、PCRPCR程序设定：1＝ 94.0℃ for 5:00 2＝ 94.0℃ for 1:00 3＝ 59.0℃ for 0:50 4＝ 72.0℃ for 1:00 5＝ Goto 2 2times6＝ 94℃ for0:507＝ 58℃ for 0:508＝72℃ for 1:009＝Goto 6 2times10＝ 94.0℃ for 0:50 11＝56.0℃ for 0:50 12＝ 72.0℃ for 1:00 13＝ Goto10 32times 14＝ 72.0℃ for 10:00 15＝ 4.0℃ for 5:00 16＝END目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：PCR反应的体系12μl：APPPrimer APP-1 μlPrimer APP-2 μlO 2μlddH2mixCW0682 6μlDNA 1μlPCR反应的体系12μl：PS1Primer PS1-1 μlPrimer PS1-2 μl内参-1 1μl内参-2 1μlmixCW06826μlDNA 1μl先在的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中一般多加两小管的量,将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次尽量避免产生气泡以便Taq酶混合均匀,最后再在各PCR管中依次加入DNA样品;引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后,EP管上会有标记,一般为x nmol,使用O,涡旋振动混匀,微型离心机离心,即可得前先用12000rpm 离心 1min,加入10x μl ddH2O稀释10倍,即加入90μl,混匀后即可得到到100μM的母液,取10μl 的母液,用ddH210μM的引物工作液;四、电泳1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种,分别用的梳子为50、25、11齿;分别用的TBE的量为90ml、45ml、25ml;用%的琼脂糖凝胶;2．点样：12μl的DNA,Marker加5μl;点样时注意逐个点样,不要点错,最好把中间的那个孔留着点Marker,这样可避免点样的出错;Marker的选择依基因片段大小而定;3．跑电泳：打开电源,150v电压,30min左右即可;4．照胶：看是否有目的条带,即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子;5．保存;。
敲基因小鼠鼠尾基因鉴定实验报告
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定：一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、核苷酸染料、Marker三、母液配置：1.10M NaOH: NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止）四、实验步骤：1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不行）2.提取DNA：1)配置工作液——20ml体系A液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml8ul 0.5M EDTAB液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开）3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下）4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱）3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA）1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ulMix 7.5ul三蒸水4.5ulDNA 2ul2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min变性：94度——30s退火：55度——30s 30个循环延伸：72度——24s72度——5min4度——∞4.琼脂糖凝胶电泳：1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方：总体积（ml）20 30 40 50 60 120琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120Tris-base 13.6gTBE 5x配方：硼酸 6.56gEDTA 0.73g双蒸水up to 250mlEg：50孔大胶的配置：琼脂糖2.4g 微波炉加热5min左右冷却至适温后加染料7.5ulTBE 1x 150ml（需考虑蒸发量）2)加样——Marker 0.5ul，样品8ul（加样前吹打2次，从右向左加样）3)电泳——150V，300mA，20min（加样孔在近负极侧）5.成像分析：Image lab 新建核酸凝胶（第一项）最后一项滤光片拨至中间放置凝胶运行保存图像编辑拍照保存6.结果及分析：1)AAA分子量为700+？2)AC3I分子量为400+？3)AAA型——只出现AAA一条带AC3I型——只出现AC3I一条带双阳型——两条带都出现野生型——AAA型老鼠没出现AAA条带或AC3I型老鼠没出现AC3I条带或双阳型两条带均未出现4)出现浅带的原因？判定为阴性还是阳性？我觉得阴性更多。
小鼠基因型鉴定是什么？小鼠基因型鉴定详细操作步骤
小鼠基因型鉴定是什么？小鼠基因型鉴定详细操作步骤小鼠基因型鉴定是指通过一定的生物学检测方法确定小鼠基因型的技术。
常用的方法包括PCR，Realtime PCR，HRM以及PCR结合测序等。
操作步骤：1、样品DNA的提取（1）剪鼠尾脚趾，1mm（2）加100ul lysls buffer， 2ul protease K，55℃消化2h（3）95℃灭活protease K 5min（4）快速离心（12000rpm 5min）注：DNA产物-20℃条件下保存鼠尾是去动物房拿的，3楼，一个房间-20℃的冰箱里。
加buffer的时候先把鼠尾戳到管子底部，再把buffer打进去，保证鼠尾沉在buffer里面（不要漂浮在上面，更不要还在管壁上）高温的仪器在窗户边上，铁锅和离心机旁边。
12000rpm的离心机是右边比较小的那台2、取20ul DNA产物，配置10管20ul PCR反应体系，具体如下：样品2ul+3种引物（每种各1ul）+ mixture 10ul + 5ulH2O=20ulprimer1：OIMR4182 commonprimer2：OIMR4183 WTprimer3：OIMR7297 muT先用比较大的EP管，加3种引物各10ul，mixture100ul，H2O50ul。
这几样东西都是放在冰箱里的管子里的，以后做，还是让学姐拿一下，毕竟我不太认识。
再分别加入10个小的EP管里，再加2ul样品。
3、PCR扩增反应reaction conditionstep temp/℃ time1 95 5min2 94 30s3 62 35s4 72 45s5 72 3min6 4 Hold。
基因编辑_鼠实验报告
实验名称：基因编辑鼠模型构建及功能研究实验时间：2023年X月X日至2023年X月X日实验地点：XX大学XX实验室实验人员：XXX、XXX、XXX一、实验背景随着分子生物学和基因编辑技术的快速发展，基因编辑技术在疾病模型构建和基因功能研究中发挥着越来越重要的作用。
本实验旨在通过CRISPR/Cas9技术对小鼠进行基因编辑，构建基因敲除和基因过表达模型，研究特定基因在生理和病理过程中的功能。
二、实验目的1. 利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除和基因过表达小鼠模型。
2. 观察基因敲除和基因过表达小鼠的表型变化。
3. 研究特定基因在生理和病理过程中的功能。
三、实验材料1. 实验动物：SPF级C57BL/6小鼠2. 工具：CRISPR/Cas9系统、电穿孔仪、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、Western blot试剂盒等3. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR引物、荧光染料、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶等4. 仪器：生物安全柜、离心机、凝胶成像系统、显微镜等四、实验方法1. 基因编辑载体构建（1）设计特异性引物，针对目标基因设计CRISPR/Cas9系统所需的sgRNA。
（2）合成sgRNA和Cas9模板DNA，构建CRISPR/Cas9系统。
（3）将sgRNA和Cas9模板DNA连接到载体上，构建基因编辑载体。
2. 基因编辑小鼠模型构建（1）将基因编辑载体电穿孔转染到小鼠受精卵中。
（2）将转染后的受精卵移植到假孕母鼠体内。
（3）观察出生小鼠的表型，筛选基因敲除和基因过表达小鼠。
3. 基因敲除和基因过表达小鼠表型观察（1）观察基因敲除和基因过表达小鼠的生长发育、行为、生理指标等。
（2）通过组织学、病理学等方法观察基因敲除和基因过表达小鼠的组织结构变化。
4. 基因功能研究（1）通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测基因敲除和基因过表达小鼠的基因表达水平。
（2）通过细胞培养、动物模型等方法研究基因敲除和基因过表达小鼠的生理和病理过程。
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
基因型鉴定心得
Cre
一种重组酶，可由噬菌体转染到细胞，催化Loxp位点间的 DNA进行特异性重组。
Loxp
34bp序列，两端是13bp的反向重复序列，中间是其定向作 用的8bp间隔区。
重组产物
根据loxp位点的位置和相对方向而不同，在一条链上单 loxp位点的DNA将被融合。
Loxp
Loxp Cre
Flp-Frt system:主要用来去除Neo
PCR鉴定
引物设计
设计原则
①引物长度一般为20~24bp
②引物碱基尽可能随机分布：GC含量约60%
③引物不应有发夹结构：即不能有4bp以上的回文序列
④引物的3‘端为关键碱基：两引物间不应有大于4bp以上的 互补序列或同源序列
⑤在3’端不应有任何互补碱基 ⑥产物大小：约200~300bp ⑦Tm值：60℃左右 ⑧特异性：即无目的条带之外的多余条带 ⑨最理想的鉴定引物，一对引物即可以区分两种基因型
模板在加入MIX之前要测定浓度 OD:260/280 纯DNA浓度OD值大约在1.8
假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物（水对照，阴性对照）。
原 因
被污染 了！！！
1.操作时动作要轻柔 2.器材要高温高压消毒 3.各种试剂事先分装，低温贮存
PCR中对照组的设立
Cre-loxp system Flp-Frt system 基因敲进—Rosa 26 工具鼠查找使用
基因型鉴定心得
取样时间
10d-14d 鼠小，尾尖部DNA充足，出血少，毛少，易操作。
取样过程
器械：眼科剪，小镊子，酒精棉，基因型检测记录表，记 号笔，1.5ml EP管（消毒） 减尾长度：1cm左右 小贴士：双人操作，一剪一消毒，两剪同时进行，三序核 对，稳准狠