Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

型
【中图分类号】Q95-331 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2001)03-0182-04
Reproduction and Genotype Identification of Smad 3 Gene Knockout Mice
有特殊生物学特性的突变体小鼠作为模型动物被广 泛应用于生物医学研究的各个领域 , 极大地促进了
生物学和医学的发展 。
SMAD3 是细胞质内介导转化生长因子-β(TGFβ)信号的传导分子之一[ 1 , 2] 。 为了研究 Smad3 基因 在脊椎动物体内的功能 , 我们用基因打靶的方法建 立了 Smad3 基因 剔除小鼠(Smad3ex8 ex8 小鼠)[ 3] 。 通 过表型分析研究发现 , Smad3ex8 ex8 小鼠发生渐进性的 白细胞增多症 、牙周炎 、胃炎 、肠炎以及粘膜表面附 近脓肿形成的慢性感染 。 对有症状的 Smad3ex8 ex8 小 鼠淋巴结的组织学及免疫表型分析显示 T 细胞有增
图中上下分别为 野生 型和突 变型 Sand3 基 因组结 构示 意图 。 小长 方框表示外显子 。 引物的位置和方 向用箭头 标出 。 探针 的位置用 短线标出 。 图 1 用于 基因型鉴 定的 PCR 引 物和 Southern 杂 交探针示 意图 Fig.1 The sketch map of PCR primers and Southern probe for genotypingThe upper is the genomic structure of the wild type Smad3 gene.The lower is the mutant allele .The small boxes indicate the exons .The arrows mark the position and direction of the primers .The short line is probe for Southern blot
(军事医学科学院实验动物中心 , 北京 100071)
【摘要】 目的 为进一步深入研究 Smad3 基因在脊椎动物发 育中的重 要作用 , 对 Smad3 基因剔除小 鼠进行保 种和繁育研究 。方法 采用基因剔除杂合子小鼠进行保种 , 通过 PCR 和 Southern 杂 交对杂合 子小鼠交配 所产生的 后代进行基因 型鉴定 , 纯合子 小鼠和 野生 型小 鼠用 于表 型 分析 , 杂 合子 小鼠 用于 留种 和繁 殖生 产 。 结 果 采用 PCR 方法对 278 只子代小 鼠进行了 基因型鉴定 , 83 只为野 生型 , 133 只为 杂合子 , 62 只为纯合子 。 结论 Smad3 基 因剔除突变能稳定遗传 。 采用杂合子小鼠保种 , 子代小鼠 三种基因型比例符合孟德尔遗传定律 。
1 .4 Southern 杂交 用 EcoRV 消化适量的染 色体 组 DNA(约 10 μg DNA 于 30 μl 反应体积), 在琼脂糖 凝胶(0 .65 %～ 0 .8 %)上缓慢电泳(22V), 24 ～ 48 h 。 将 DNA 转移到硝酸纤维素膜上后用常规方法进行 杂交[ 5] 。
中国实验动物学报 2001 年 9 月第 9 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Si n, September 2001 , Vol .9.No .3
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强的增殖能力及活化 的表型 。 进 一步的研究表明 Smad3ex8 ex8 胸腺 细 胞及 外 周 T 细 胞 彻 底失 去 了对 TGF-β 的应答 。 此外 , Smad3ex8 ex8 突变纯合子小鼠还 表现出典型的骨性关节炎(待发表数据)和创伤愈合 速度加快[ 4] 的表型 。 因此 , Smad3ex8 ex8 突变纯合子小 鼠有可能作为粘膜免疫缺陷和骨性关节炎的模型动 物 , 研究其保 种和繁 育方 法对于 进一 步深 入研究 Smad3 介导的 TGF-β 信号在调节肌体 免疫系统 、骨 骼发育和创伤愈合等生理和病理过程中的作用具有 十分重要的意义 。
【Key words】 Smad3 gene knock-out mice ;Genotype
基因打靶技术是一种通过同源重组按预期方式 改变生物活体的遗传信息的实验手段 。 小鼠胚胎干 细胞(ES 细胞)取自小鼠早期胚胎的内细胞团 , 它能 在体外培养并保留发育的全能性 。 在体外进行遗传 操作后 , 将它重新植回小鼠胚胎 , 它可发育成胚胎的 各种组织 , 从而形成嵌合体小鼠 。 如果这些携带突 变基因的 ES 细胞能发育成小鼠的生 殖细胞 , 通过 杂交就可以获得突变基因的纯合小鼠 。 同源重组技
2001 年 9 月 第 9 卷 第 3 期
中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA
Sep ., 2001 Vol .9 No .3
Smad3 基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定
孙岩松 吕雅歆1 时彦胜 战大伟 李文龙 张爱兰 杨晓1
[ 基金项目] 北京市科技项目专项基金(954981000);国 家自然科 学基金(39970413);国家高技术研究发展计划(102-08-08-02)
[ 作者简介] 孙 岩松 , 男(1964 —), 高 级兽医 师 , 研究 方向 :实验 动物繁育
1 军事医学科学院生物工程研究所 。
术结合这种 ES 细胞系统 , 使得人们可以方便 地将 各种突变引入小鼠体内 , 以传统实验手段无法比拟 的速度获得各种突变体小鼠 。由此而产生的许多具
2 结果
2 .1 Samd3 基因剔除小鼠的基因型鉴定 Smad3 基 因剔除导致小鼠免疫失调 , 易患感染 , 并最终导致突 变小鼠在出生后 1 ～ 10 月间死亡 。 因此 , 不能采用 突变小鼠纯合子进行保种和繁殖 。Smad3 杂合子小 鼠在生长发育 、性成熟 、生长寿命等方面与野生型小 鼠相比均无明显差别[ 1] , 被用于保种和繁殖的研究 。 首先通过将 Smad3 雌性杂合子小鼠与相同遗传背景 的雄性小鼠杂交 , 获得足够数量的 Smad3 杂合子小 鼠 , 再进行兄妹交配或回交 。 杂合子小鼠交配所产 生的子代小鼠分属野生型 、杂合型和纯合型等 3 种 基因型 , 所以应有简便易行的方法对 3 种不同基因 型的小鼠进行甄别 。聚合酶链式反应(PCR)因其迅 速 、灵 敏 、简 便 的 特点 成 为 首 选 。 我们 根 据 研 制 Smad3 基因剔除小鼠的打靶策略设计了 3 种 PCR 引 物(见图 1), 通过 2 个 PCR 反应即可以区别 3 种不 同的基因型 。 同源重组发生后 , 中靶的 Smad3 突变 等位基因中 , pGK-neo 基因替代插入 Smad3 第 8 外显 子的位 置 , 删 除了 包括 Smad3 第 8 外显子 在内 的 1 kb的 Hind Ⅲ-Asp718 染色体组 DNA 片段 。 引物 1
【Abstract】 Objective To further study the important role of Smad3 gene during the vertebrate development , and reproduction of Smad3 gene knockout mice .Methods The heterozygous mice were used for breeding .The genotypes of the offspring were characterized using PCR and Southern blot .Both homozygous and wild type mice were used for phenotype analysis, and the heterozygous mice were used for propagating .Results The genotypes of 278 offsprings were characterized using PCR.83 mice are wild type , 133 are heterozygotes, 62 are homozygotes .Conclusion The targeted Samd3 mutant gene could be inherited stably . The ratio of 3 genotypes of the offspring fits the Mendel′s laws .
1 材料和方法
1 .1 Smad3 基因剔除小鼠 1999 年 3 月 22 日由美 国引进 2 只雌性 Smad3 基因剔除杂合子小鼠(美国 NIH 邓初夏博士惠赠)。为保存这一突变基因 , 采用 另外一种具有相同遗传背景的基因剔除小鼠的 2 只 雄性小鼠分别与之交配 , 产生的后代经过基因型鉴 定 , 选取只含有 Smad3 突变基因的 Smad3 杂合型小 鼠留种 , 再进行兄妹交配或回交 。 1 .2 鼠尾染色体组 DNA 的制备 剪下 10 ～ 14 日 龄小鼠尾 尖 0.5 cm , 置 于组 织裂解 缓冲 液(0 .5 % SDS , 0 .1 mol L NaCl , 0 .05 mmol L EDTA , 0 .01 mmol L Tris .Cl , pH8 .0 , 蛋白酶 K , 100 μg ml)中 , 50 ℃保温 过夜 。 每管加 入 200 μl 饱和的 NaCl (6 mol L), 将 Eppendorf 管置于纸盒中剧烈晃动 200 次 , 置于冰上 , 10 min 。 室温 14 000 r min 离心 , 10min 。将上清 500 μl 转移至干净的 Eppendorf 管中 , 每管再加入 0 .8 ml 乙醇 , 混匀 。14 000 r min 离心 , 5 min 。将 DNA 沉淀 室温干 燥 , 重悬 于 50 ～ 100 μl TE 中 , 37 ℃保 温至 DNA 完全溶解后可用于 PCR 或 Southern-blot 分析 。 1 .3 用于基因型鉴定的 PCR 引物及反应 引物 1 (5′-CCACTTCATTGCCATATGCCCTG-3′)和引物 2(5′CCCGAACAGTTGGA TTCACACA-3′)用于鉴定野生型 的 Smad3 等位基因 。 引物 1 位 于删除片段的 5′-上 游 , 而引物 2 位于删除片段之内 。 这对引物能从野 生型 及 Smad3ex8 + , 而非 Smad3ex8 ex8 小 鼠 染 色 体 组 DNA 中扩增一段约 400 bp 的片段 。 引物 1 和位于 pGK-neo 基 因 中 的 引 物 3 (5′-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3′)用来检测突变的 Smad3 等位基因 。用 这对引物可在 Smad3ex8 + 和 Smad3ex8 ex8 小鼠中检测到 约 250bp 的片段 , 在野生型 小鼠中没有任 何信号 。 PCR 反应条件为 50 ℃, 10 min ;94 ℃, 2 min ;94 ℃, 30 s , 60 ℃, 30 s , 72 ℃, 2 min , 30 循环 ;72 ℃, 10 min 。