昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定医学PPT课件
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杆状病毒滴度检测
如何提高FuGENE HD转染实验成功率FuGENE, 转染摘要：在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。
基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。
培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。
有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。
务必要使培养基避光保存。
因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。
胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。
因此血清易受显著生物学变异的影响。
添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。
CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值。
细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。
来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。
昆虫分子鉴定技术简介PPT课件
近年来的突破与进展
高通量测序技术的出现使得大规模昆 虫基因组测序成为可能，为昆虫分子 鉴定提供了更丰富、更准确的遗传信 息。
随着人工智能和机器学习技术的发展， 基于人工智能的昆虫分子鉴定方法也 取得了重要进展，如深度学习算法在 昆虫分类中的应用。
基于基因组学和进化生物学的研究， 科学家开发出了一系列高效的昆虫分 子鉴定方法，如DNA条形码技术、多 基因分析等。
总结词
微卫星DNA标记技术是一种基于DNA多态性的鉴定方法，通过分析基因组中 重复序列的长度变异来区分物种。
详细描述
微卫星DNA标记技术具有高分辨率和高灵敏度，适用于种群遗传学、系统发育 和亲缘关系的研究。该技术通过检测微卫星位点的重复序列长度，可以精确地 鉴定昆虫物种。
转录组高通量测序技术，对昆虫的基因表达和基因组进行全面分析，为昆虫鉴定提供更深 入的分子信息。
详细描述
转录组学技术通过分析不同发育阶段或不同生理状态下昆虫的转录本，揭示物种间的基因表达差异。基因组学技 术则对整个基因组进行测序和组装，为昆虫的系统发育和进化研究提供基础数据。这些技术结合传统的形态学特 征，可以更全面地鉴定昆虫物种，并深入了解其生物学特性和系统发育关系。
建立质量控制体系
对技术过程进行全程监控，确保数据准确性和可靠性。
加强技术培训与交流
组织技术培训和学术交流活动，提高技术人员的技术水平。
06
参考文献
参考文献
[请在此处插入参考文献3]
[请在此处插入参考文献2]
[请在此处插入参考文献1]
01
03 02
THANKS
感谢观看
昆虫分子鉴定技术具有高精度、高分辨率和高灵敏度的特点 ，能够解决传统形态学鉴定方法难以解决的问题，尤其在鉴 定形态相近、分类地位争议的昆虫种类时具有明显优势。
杆状病毒-课件
杆状病毒杀虫剂的研究 杆状病毒表达系统 杆状病毒作为基因治疗的载体
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
昆虫表达系统 ppt课件
基因表达与调控
真核表达_昆虫杆状病毒表达系统
PPT课件
1
真核表达系统的种类和常用载体
1.真核表达系统的种类 酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞 转基因动物 植物反应器
2.真核表达载体 质粒：真核表达元件、
真核抗性
病毒载体：改建后
SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒
而真核细胞病毒的基因是不连续的的无内含子?基因重叠即同一段dna片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子病毒基因组dna序列中功能上相关的蛋白质的基因或rrna的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位形成一个功能单位或转录单元多顺反子?除了反转录病毒以外一切病毒基因组都是单倍体每个基因在病毒颗粒中只出现一次昆虫表达系统6构建真核表达系统细胞必需表达元件?原核dna序列?启动子?增强子?拼接信号?终止子和多聚腺苷化信号?筛选标记?动物病毒基因序列昆虫表达系统7病毒载体优点?真核细胞可识别的启动子?报告基因?感染周期可持续复制?部分载体可整合入基因组?部分载体本身带有完整的复制及表达元件?部分载体具有宿主细胞特异性?识别受体?假病毒颗粒?杆状病毒及其基因组模型昆虫表达系统8昆虫杆状表达系统简介?杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群发现最早研究最多且实用意义很大的昆虫病毒
PPT课件
2
SV40病毒
• 《SV40》(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒 40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发 现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双 链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病 毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位， 这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完 成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
真核表达_昆虫杆状病毒表达系统
PPT课件
1
真核表达系统的种类和常用载体
1.真核表达系统的种类 酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞 转基因动物 植物反应器
2.真核表达载体 质粒：真核表达元件、
真核抗性
病毒载体：改建后
SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒
而真核细胞病毒的基因是不连续的的无内含子?基因重叠即同一段dna片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子病毒基因组dna序列中功能上相关的蛋白质的基因或rrna的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位形成一个功能单位或转录单元多顺反子?除了反转录病毒以外一切病毒基因组都是单倍体每个基因在病毒颗粒中只出现一次昆虫表达系统6构建真核表达系统细胞必需表达元件?原核dna序列?启动子?增强子?拼接信号?终止子和多聚腺苷化信号?筛选标记?动物病毒基因序列昆虫表达系统7病毒载体优点?真核细胞可识别的启动子?报告基因?感染周期可持续复制?部分载体可整合入基因组?部分载体本身带有完整的复制及表达元件?部分载体具有宿主细胞特异性?识别受体?假病毒颗粒?杆状病毒及其基因组模型昆虫表达系统8昆虫杆状表达系统简介?杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群发现最早研究最多且实用意义很大的昆虫病毒
PPT课件
2
SV40病毒
• 《SV40》(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒 40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发 现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双 链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病 毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位， 这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完 成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
昆虫杆状病毒杀虫剂课件
田蛾克为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和
苏云金杆菌复配等。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•17
结语
昆虫杆状病毒杀虫剂具有对人、畜和环境安全，
不易产生抗性等优点，且符合IPM农业可持续发展
的要求。以开发得最为成功的棉铃虫病毒杀虫剂为
例，至今的十几年间，累计生产逾2000t，推广面
积超过66.67万公顷。但是，我国各类生物农药的
个方面：
⑴修饰病毒本身基因以提高杆状病毒的感染力;
⑵在杆状病毒基因组中插入外源基因以增强病
毒毒力（研究较多）;
⑶用异源病毒重组来扩大杆状病毒杀虫谱。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•13
⑴修饰病毒本身基因
•
e.g.缺失egt基因
egt基因是杆状病毒在个体水平调控感染宿主生长发育
的唯一已知基因。缺失egt基因的重组病毒可引起幼虫生长
发育代谢的失调, 加速感染虫体的死亡。
OReily等(1991)发现银纹夜蛾核多角体病毒的一个早期
非必需基因蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因, 该基因
受早期启动子控制, 编码的一个506aa蛋白能阻止幼虫蜕皮
和化蛹, 促进病毒自身的增殖。缺失该基因的重组病毒能比
野生型病毒提早27.5h杀死粉纹夜蛾幼虫, 受感染的幼虫取食
量也减少了40% 。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•14
⑵插入外源基因
e.g.插入植物蛋白酶抑制剂基因
植物蛋白酶抑制剂基因编码的植物蛋白酶抑制
因子作为植物抵抗害虫的天然防御体系, 近年来已
引起人们的注意。季平等(1996)把慈姑蛋白酶抑制
剂B基因插入家蚕BmNPV 基因组中, 获得了带慈姑
蛋白酶抑制剂B基因的重组家蚕BmNPV。重组病毒
苏云金杆菌复配等。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•17
结语
昆虫杆状病毒杀虫剂具有对人、畜和环境安全，
不易产生抗性等优点，且符合IPM农业可持续发展
的要求。以开发得最为成功的棉铃虫病毒杀虫剂为
例，至今的十几年间，累计生产逾2000t，推广面
积超过66.67万公顷。但是，我国各类生物农药的
个方面：
⑴修饰病毒本身基因以提高杆状病毒的感染力;
⑵在杆状病毒基因组中插入外源基因以增强病
毒毒力（研究较多）;
⑶用异源病毒重组来扩大杆状病毒杀虫谱。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•13
⑴修饰病毒本身基因
•
e.g.缺失egt基因
egt基因是杆状病毒在个体水平调控感染宿主生长发育
的唯一已知基因。缺失egt基因的重组病毒可引起幼虫生长
发育代谢的失调, 加速感染虫体的死亡。
OReily等(1991)发现银纹夜蛾核多角体病毒的一个早期
非必需基因蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因, 该基因
受早期启动子控制, 编码的一个506aa蛋白能阻止幼虫蜕皮
和化蛹, 促进病毒自身的增殖。缺失该基因的重组病毒能比
野生型病毒提早27.5h杀死粉纹夜蛾幼虫, 受感染的幼虫取食
量也减少了40% 。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•14
⑵插入外源基因
e.g.插入植物蛋白酶抑制剂基因
植物蛋白酶抑制剂基因编码的植物蛋白酶抑制
因子作为植物抵抗害虫的天然防御体系, 近年来已
引起人们的注意。季平等(1996)把慈姑蛋白酶抑制
剂B基因插入家蚕BmNPV 基因组中, 获得了带慈姑
蛋白酶抑制剂B基因的重组家蚕BmNPV。重组病毒
医学昆虫与防治ppt课件
仲丁威
蚊
灭效好
蝇
灭效一般
2-仲丁基苯基
-N-甲基氨基
蟑螂
差
甲酸酯
45
杀虫剂安全合理使用
根据施药目的和场所选择合适药物和施药方式
登革热流行 室内日常
超低容量大面积喷雾杀成蚊 滞留喷洒
46
杀虫剂安全合理使用
抗药性调查及合理轮换混用杀虫剂
延缓产生抗药性 减少对环境的污染
提高防制效果
增效？
减效？
47
杀虫剂安全合理使用
12
命名法
当某一学名中的属名被修订或种名被更改时， 原定名人的姓氏要加圆括号，以便查对
三化螟最初学名为Schoenobius incertulas Walker,1863
70年代将该种移入Tryporyza属，学名成为 Tryporyza incertulas （Walker）
80年代，又将该种移入Scirpophaga属，学名又 成为Scirpophaga incertulas （Walker）
元
等
次要分类阶元
科与属之间的“族”，Tribe
8
分类体系对分类学的意义
1.使分类学成为有效的信息存贮系统
2. 使分类学的预测功能成为可能。
分类学能根据已有的研究去预测研究不完善的生物。例如， 昆虫几乎总是先根据外部形态进行分类。然而，一旦用形态 标准把一种昆虫归于某一具体的单元，就可根据单元内其他 研究较好的成员预测其习性（包括生活史）、内部构造和生 理。
细胞核学（以及其他细胞学区别）、同工酶、核 酸序列、基因表达和调控等。
23
模式标本
模式标本是指建立种级新分类单元 时依据的标本，包括正模 （holotype）、副（paratype ） 等等。
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。
该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。
说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
背景技术[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。
杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。
杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。
[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。
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Subculturing：
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
12
病毒扩增&蛋白表达
扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究
疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
22
材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定 进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
14
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
15
16
注意事项：
11
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变 慢或不增殖 脱落 或 融合(VSV/G) 裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
8
重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
9
重组Bacmid的产生
10
重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
ELISA抗体 体液免疫检测
中和抗体
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
18
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
7
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
杆状病毒表达系统 & 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
1
杆 状 病 毒 表 达 系 统
昆虫细胞的培养
重组pFastBac质粒的构建
重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒
蛋白表达&病毒扩大
2
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
13
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
3. 细胞和细胞培养试剂
（1）对数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
3
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
4
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
5
Expermiantal outline
6
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
17
疫 苗 免 疫 动 物 后 免 疫 效 力 评 价
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值再计算比值和滴度。
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中和抗体
微量中和实验技术
20
中和实验原理
21
分类
固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
12
病毒扩增&蛋白表达
扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究
疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
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材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定 进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
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BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
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注意事项：
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获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变 慢或不增殖 脱落 或 融合(VSV/G) 裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
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重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
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重组Bacmid的产生
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重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
ELISA抗体 体液免疫检测
中和抗体
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
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ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
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昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
杆状病毒表达系统 & 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
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杆 状 病 毒 表 达 系 统
昆虫细胞的培养
重组pFastBac质粒的构建
重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒
蛋白表达&病毒扩大
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Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
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杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
3. 细胞和细胞培养试剂
（1）对数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
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Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
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Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
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Expermiantal outline
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昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
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疫 苗 免 疫 动 物 后 免 疫 效 力 评 价
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值再计算比值和滴度。
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中和抗体
微量中和实验技术
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中和实验原理
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分类
固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法（用的很少）