微生物实验报告——真菌的观察

酵母菌是单细胞个体，大小是细菌的几倍到几十倍， 大多数出芽生殖，也可通过产生子囊孢子有性生殖。酵母 菌的观察一般采用美兰染液水浸片法，因为普通的涂片法 可能损伤酵母菌细胞。采用美兰染液水浸片法还可以鉴别 酵母菌的死活。酵母菌活细胞新陈代谢具有较强的还原能 力，可以将美兰显蓝色的氧化型转变为无色的还原型，而 死细胞和代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后呈 蓝色或淡蓝色。
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根据公式：目微尺每格长度=重合线间台微尺格数×10/重合线间目微尺格数 计算出不同放大倍数下目微尺每格所代表的实际长度。 ⑶.目微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母菌浸片，用高倍镜和油镜分别测量酵母菌直径或长、 宽分别占目微尺的格数，最后将所得格数乘以目镜测微尺每格代表的长度，即为酵母菌的实际大小。 3. 酵母菌显微计数。 ⑴.将酵母菌培养液稀释一定的倍数，保证在血细胞计数板上每个中格能看到几十到一百个左右的菌体。 ⑵.在洁净的计数板上平放一盖玻片，使盖玻片完全覆盖两个平台上的计数室方格。用移液枪吸取摇匀 的稀释菌液在盖玻片一段边缘滴一小滴，使菌液在毛细作用下自动进入计数室，静置 5min 使菌体自然 沉降。
黑曲霉菌丛呈黑褐色，菌丝发达， 多 分 枝 ，是 有 多 核 的 多 细 胞 真 菌 。分 生 孢子梗由特化了的厚 壁而膨大的菌丝 细 胞（ 足 细 胞 ）上 垂 直 生 出 ，分 生 孢 子 头 状 如“ 菊 花 ”，分 生 孢 子 为 球 形 ，呈 黑、黑褐色，平滑或粗糙。
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根霉的 菌丝无隔膜， 营养菌丝体 上产生匍匐 枝，匍匐枝的 节间形成特 有的假根，从 假根处向上 丛生直立、不 分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子。孢子囊内囊轴明显，球形或近球 形，囊轴基部与梗相连处有囊托。
（上图）酵母菌出芽生殖
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4. 放线菌形态观察。
放线菌是一种革兰氏阳性细菌，菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝组成。放线菌的观察一般采 用扦片法或玻璃纸法。扦片法是将灭菌的盖玻片斜插入接种有放线菌的平板，使放线菌沿盖玻片和培养 基交接处生长，附着在盖玻片上，从而有利于观察放线菌的完整形态和不同生长时期。 5. 霉菌形态观察。
实验结果： 1. 酵母菌形态观察。
在低倍镜视野中可以看到部分酵母菌呈蓝色，部分酵母菌无色，菌体均匀分散在视野中。高倍镜下 观察可以看到酵母菌细胞大都呈椭圆蛋形，细胞内有圆形颗粒状小泡，个别个体能看到大液泡。有一部 分菌体上突出圆形小泡，即酵母菌的出芽生殖。有时可以看到酵母菌细胞变成细长状连在一起形成假菌 丝。
规格为 16×25 的血细胞计数板计数室方格示意 ⑶.将加好样品的计数板放在载物台上，低倍镜找到计数室位置后用高倍镜计数。计数时按上图阴影区 域取样，设 5 个中方格中总菌数为 A，菌液稀释 B 倍，则：
1ml 菌液中总菌数 = A×5×104×B 4．放线菌形态观察。（扦片法）
⑴.准备。配制高氏Ⅰ号培养基，倒平板。盖玻片灭菌。 ⑵.接种。无菌操作用接种环挑取少量青色放线菌和傅氏放线菌在平板上密集划线接种。 ⑶.插片。无菌操作用镊子取灭菌盖玻片以约 45°角插入平板琼脂接种线上。 ⑷.培养。将平板倒置于 28℃温箱培养 3 到 5 天。 ⑸.镜检。用镊子取出盖玻片，将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接用显微镜观察。 5．霉菌形态观察。(载玻片法) ⑴.在培养皿底部铺一张略小于皿底的圆形滤纸片，在其上放一个 U 形玻璃管，在玻璃管上放一块载玻 片和至少两块盖玻片（如下图），盖上皿盖，高压常规灭菌。 ⑵.配制马铃薯琼脂培养基，灭菌后倒平板，使琼脂层厚度约 1mm 即可。 ⑶.无菌操作用解剖刀在马铃薯琼脂薄层平板上切下 1cm2 左右的琼脂快，将其移至培养皿的载玻片上， 每片两块。
毛霉菌 丝 无 隔 、多 核 、分 枝 状 ，在 基 物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。 菌 丝 体 上 直 接 生 出 单 生 、总 状 分 枝 或 假 轴 状 分 枝 的 孢 囊 梗 。各 分 枝 顶 端 着 生 球 形 孢 子囊，内有形状各异的囊轴，但无囊托。 囊 内 产 大 量 球 形 、椭 圆 形 、壁 薄 、光 滑 的 孢囊孢子。
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假菌丝
出芽生殖
（上图）0.1%吕氏美兰染液染色 30min 的酵母菌 400×
2. 酵母菌大小测定。
⑴.目微尺的标定。
不同放大倍数下目微尺每小格代表的实际长度
显微镜放大率
100×
400×
1000×
每格实际长度/μm
9.80
2.43
0.97
⑵.酵母菌大小测定结果：
使用 40×和 100×物镜分别测量分散独立的酵母菌细胞的大小，较大的个体长约 7.3μm，宽约 4.8-4.9
283
176
267
A/（个）
原菌液浓度（个 /ml）
8.7×107
1.4×108
8.8×107
1.3×108
由表可见，不同滴加方式以及使用不同规格的盖玻片对计数结果的影响不大，所得结果在同一个数 量级。此次酵母菌显微计数得到的酵母菌原液的浓度约为 0.87-1.4×108 个/ml。
4. 放线菌形态观察。
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实验反思： 1. 在酵母菌大小测定实验中，目微尺的安放方式略有差异便会显著地影响校正数据。比如目微尺放
入 目 镜 后 ，目 镜 末 端 的 旋 盖 没 有 旋 紧 会 导 致 目 微 尺 在 视 野 中 偏 小 ；如 果 目 微 尺 直 径 比 镜 筒 直 径 略 小 还 可 能 导 致 旋 紧 后 目 微 尺 平 面 与 光 路 不 垂 直 。所 以 安 装 目 微 尺 时 要 反 复 尝 试 ，直 至 目 微 尺 安 放 到最恰当的位置。 一般来说，如果使用的目微尺长度为 10mm，目镜放大率为 10 倍，镜台微尺长 1mm，物镜放大 率为 10 倍，则视野中目微尺的总长应与台微尺总长相等，即两尺刻度应完全重合。 虽 然 目 微 尺 安 放 有 偏 差 不 会 影 响 最 终 测 量 结 果 ，但 由 于 校 正 后 目 微 尺 每 个 小 格 的 实 际 长 度 不 是 整 数，所以可能会给测量带来一定的不便。 2. 在酵母菌的血球计数板显微计数中，尝试使用不同的加样方式并未对计数结果产生很大影响。相 比 较 而 言 ，如 果 在 盖 玻 片 边 缘 的 平 台 加 样 ，优 点 是 可 以 一 次 计 数 两 种 不 同 的 细 胞 或 同 种 细 胞 的 两 个 不 同 浓 度 的 悬 浊 液 ，而 且 计 数 完 毕 后 计 数 板 的 清 洗 相 对 容 易 ，缺 点 是 必 须 使 用 精 密 的 移 液 设 备 如移液枪。 细 胞 的 血 球 平 板 计 数 结 果 是 活 细 胞 和 死 细 胞 的 总 和 ，虽 然 不 能 反 映 活 细 胞 数 ，但 其 数 据 可 以 与 比 浊数据换算，而且操作快捷，兼具镜检的作用，所以具有很强的可用性。 3. 在放线菌的观察实验中，发现放线菌的气生菌丝生长极具方向感，顶端分支较多，但几乎看不到 分 生 孢 子 丝 。一 般 分 生 孢 子 丝 由 略 靠 近 培 养 基 的 气 生 菌 丝 生 长 出 来 ，颜 色 更 深 ，有 的 分 生 孢 子 丝 形 成 规 则 的 螺 旋 形 ，有 的 螺 旋 脱 落 ，孢 子 丝 断 裂 成 大 量 近 球 形 孢 子 。可 见 放 线 菌 虽 是 细 菌 ，但 有 类似霉菌的生长结构，不同部位分化明显。 4. 在霉菌的载玻片培养观察中，由于接种量较多，四种霉菌的生长都很旺盛，以致大多数菌丝体之 间 相 互 交 错 、遮 挡 ，很 难 看 清 完 整 的 菌 体 形 态 。而 且 在 未 接 种 孢 子 的 琼 脂 块 边 缘 也 有 大 量 菌 体 生 长 ，说 明 霉 菌 的 繁 殖 力 很 强 ，如 果 要 获 得 更 好 的 观 察 效 果 ，应 控 制 接 种 量 ，并 在 霉 菌 生 长 的 某 些 阶段观察。
霉菌是一种真菌，菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝组成，其菌丝比放线菌的菌丝粗几倍到 几十倍。本实验采用载玻片培养观察法，即在无菌操作的情况下，将霉菌接种到载玻片上的琼脂薄层， 这样霉菌孢子萌发后可以在盖玻片和载玻片之间的空间生长，从而容易观察其完整的结构和不同的生长 时期。
青霉菌属多细胞真菌，整个菌丝 体分为伸入营养基质中吸取营养的 基质菌丝和伸向空气中的气生菌丝， 菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔， 细胞内通常为多核。其分生孢子梗经 过多次分枝，产生几轮对称或不对称 的小梗，形如扫帚，称为帚状体。
螺旋状孢子丝
（上图）青色放线菌孢子丝 400× 螺旋状孢子丝
（上图）傅氏放线菌孢子丝 400×
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（上图）傅氏放线菌气生菌丝末端的开环、钩形孢子丝 400× 在放线菌的观察中可以看到，放线菌有发达的交错的基生菌丝，在基生菌丝之外，有延伸长度 更大的气生菌丝。气生菌丝沿着载玻片向远离培养基的方向伸展，某些部分分化成为孢子丝，大部 分 孢 子 丝 为 波 浪 形 或 不 同 程 度 的 螺 旋 形 ，周 围 有 孢 子 散 落 。在 最 远 离 培 养 基 的 一 段 ，气 生 菌 丝 细 长 ， 且 有 不 同 程 度 的 分 支 和 卷 曲 （ 如 上 图 ）。 5. 霉菌形态观察。
显微镜测量微生物大小需借助目镜测微尺和镜台测微尺的配合。 镜台测微尺是一张中央封固有标准刻度的特制载玻片，刻尺总长 1mm，划分为 10 个大格和 100 个小格， 每小格长度为 0.01mm。镜台测微尺的作用是校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺是一块中央有精确等分刻度的圆形玻璃片，可嵌入目镜内焦点处。使用前需用镜台测微尺校 正，获得一定放大倍数的目镜和物镜下每小格所代表的相对实际长度。 2. 显微计数法。 显微计数法是将少量样品的悬浮液置于一种具有确定容积的载玻片上，在显微镜下直接观察、计数的方 法。 本实验使用血细胞计数板对酵母菌进行计数。血细胞计数板是由 4 条沟槽和 3 个平台构成的特制载玻片， 中间较宽的平台被横槽隔成两半，每一边的平台上刻有一个方格网，中间的大方格即为计数室。 血细胞计数板的大方格分两种规格：25×16 和 16×25，都有 400 个小格。每一个大方格的面积为 1mm2， 盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间计数室的容积为 0.1mm3。 计数时，通常数 5 个中方格的总菌数，求得平均值后可计算出 1ml 菌液中的总菌数。 3. 酵母菌形态观察。