胶体金技术
免疫胶体金技术
The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size . The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.
. 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大
How are the antibodies coupled to the gold?
Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena : a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.
胶体金法各种方法法原理
胶体金法各种方法法原理胶体金（colloidal gold）是一种常见的纳米材料，广泛应用于生物医学、光电子学以及化学分析等领域。
胶体金法则是制备胶体金纳米颗粒的一种常用方法，它包括了各种不同的制备方法。
本文将详细介绍胶体金法的各种方法和原理。
一、胶体金法的概述胶体金法是指利用化学还原或还原剂将金离子还原成金原子并使其聚集形成胶体金颗粒的过程。
胶体金颗粒具有良好的可控性和活性，可以通过调节制备条件来控制其形状、尺寸和表面性质，便于在各个领域的应用中发挥优越性能。
二、化学还原法化学还原法是制备胶体金的一种常见方法。
其原理是通过将金离子与还原剂反应，使金离子还原为金原子，形成胶体金颗粒。
常用的还原剂有氨水、柠檬酸等。
这种方法制备的胶体金颗粒形状和尺寸较均匀，可以通过调节还原剂浓度、反应时间和温度等参数来控制颗粒的大小和形状。
三、光化学法光化学法是一种利用光照射来控制胶体金纳米颗粒形成的方法。
在该方法中，金离子在紫外光照射下被激发产生自由电子，然后与还原剂发生反应，形成胶体金颗粒。
这种方法具有反应速度快、颗粒形状可调控等优点。
光化学法的适应范围广，可以制备不同形状和尺寸的胶体金颗粒。
四、微乳液法微乳液法是一种利用乳化剂将金离子包裹在微乳液中，通过还原剂将金离子还原为金原子，最终生成胶体金颗粒的方法。
微乳液具有稳定性好、溶剂消耗少等特点，在胶体金制备中广泛应用。
该方法不受金离子浓度的限制，能够制备出较大尺寸的胶体金颗粒。
五、溶胶-凝胶法溶胶-凝胶法是一种将金离子逐渐转化为胶体金的方法。
首先，将金离子转化为胶态溶胶，然后通过加热或干燥使其凝胶，最终形成胶体金凝胶。
该方法可以制备出较大尺寸的胶体金颗粒，也可用于制备具有复杂结构的胶体金材料。
六、电化学法电化学法是一种利用电化学反应制备胶体金的方法。
在电化学细胞中，金阳极上的金离子被还原为金原子，并在阴极表面聚集形成胶体金颗粒。
该方法具有较高的纯度和良好的控制性能，可用于制备高质量的胶体金。
胶体金技术总结Ⅱ
胶体金技术总结Ⅱ一、胶体金技术原理胶体金技术的基本原理是将金金属离子还原成金纳米颗粒并通过其中一种方法使其分散在溶液中。
金纳米颗粒可以通过改变反应条件来调控其形貌和大小，以及表面性质。
其中，分散性是胶体金技术的重要特点，因为金纳米颗粒只有在分散状态下才能充分发挥其特殊性质。
二、胶体金技术制备方法化学还原法是最常用的制备胶体金的方法之一、它通过将金离子还原为金金属颗粒，并通过表面活性剂、电解质等调控分散性。
化学还原法制备的胶体金颗粒粒径较小且分散性好，但对条件要求较高。
溶胶-凝胶法是一种将溶胶中的颗粒逐渐转变为凝胶的制备方法。
通过控制凝胶形成的条件，可以调节金纳米颗粒的形貌和大小。
沉积法是通过将预制的胶体金颗粒沉积到底物表面，制备具有特定功能的薄膜或涂层。
该方法可以制备出均匀、稳定的胶体金薄膜，并且可以调控颗粒的形貌和密度。
光化学法是通过光化学反应将金离子还原为金颗粒。
光化学法制备的胶体金颗粒分散性好，并且可以调控颗粒的形貌和大小。
三、胶体金技术应用1.材料科学方面，胶体金可以用于制备纳米尺度的电子材料，如导电薄膜、导电纳米线等。
此外，胶体金还可以作为催化剂、催化剂载体、光催化材料等。
2.生物医学方面，胶体金颗粒具有良好的生物相容性和生物活性，可以用于制备药物载体、生物传感器、光热治疗等。
胶体金的表面还可以修饰生物分子，用于生物成像、生物分析等应用。
3.传感器方面，胶体金可以用于制备高灵敏度、高选择性的传感器。
通过修饰胶体金表面的功能分子，可以实现对特定分子的检测，并且可以通过纳米尺度的效应提高传感器的性能。
4.光电子方面，胶体金颗粒具有优异的光学性质，可以用于制备光电器件，如光伏器件、光探测器等。
胶体金颗粒的表面还可以修饰光子晶体，制备具有特殊光学性质的材料。
总之，胶体金技术是一种具有广泛应用前景的技术。
通过调控金纳米颗粒的形貌、大小和表面性质，可以制备出具有特殊功能的材料，并用于材料科学、生物医学、传感器、光电子等领域。
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理介绍胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Test）是一种常用于快速、便捷地检测生物体内特定分子的方法。
该技术基于免疫层析原理，利用胶体金颗粒作为信号指示剂，实现对目标分子的高灵敏检测。
原理胶体金免疫层析技术主要依赖于抗原-抗体的专一性识别和相互结合。
当胶体金颗粒与特异性抗体结合后，形成颗粒/抗体/抗原复合体。
通过将样品与含有抗原的试剂盒进行反应，可使目标分子与胶体金颗粒上的特异性抗体结合，形成颗粒/抗体/抗原/目标分子复合体。
操作步骤使用胶体金免疫层析技术进行检测通常需要以下步骤：1.样品处理–收集待测样品，并进行必要的前处理，例如离心、稀释等。
–如果样品是固体，需要先进行溶解或悬浊处理。
2.反应溶液的制备–根据试剂盒的说明书，将试剂溶解或稀释到适当的浓度。
3.准备试剂盒–打开试剂盒包装，并将提供的试剂按照指示加入到试剂盒中。
4.加样–使用专用的吸管或滴管，将处理好的样品滴入试剂盒的样品孔中。
5.反应–让样品与试剂盒中的抗体共反应一定时间，通常为几分钟。
6.拍照解读–将试剂盒放置在专门的解读器上，并对结果进行解读。
–解读器会对胶体金颗粒的颜色进行分析和判断，从而得出检测结果。
7.结果判读–根据解读器显示的结果，确定样品中目标分子的存在与否。
–通常，胶体金免疫层析技术结果可分为阴性、阳性或无效，具体判读标准需根据试剂盒说明书确定。
优势和应用领域胶体金免疫层析技术具有以下优势和应用领域：1.快速：检测时间短，通常在几分钟内可以得出结果。
2.简便：操作简单，无需复杂的设备和专业技术人员。
3.准确：具备高灵敏性和特异性，可以有效地识别目标分子。
4.可视化：结果直接显示在试剂盒上，无需显微镜等设备。
5.应用广泛：可以用于临床医学、环境检测、食品安全等多个领域。
局限性和发展趋势胶体金免疫层析技术虽然具有许多优点，但也存在一些局限性：1.灵敏度限制：相比于其他方法，如PCR和ELISA，胶体金免疫层析技术的灵敏度相对较低。
《免疫胶体金技术》课件
简便操作
免疫胶体金技术操作简便，不需要复 杂的仪器和设备，降低了对实验条件 和技术的要求。
VS
该技术适用于基层医疗机构、实验室 及家庭自测等多种场景，方便快捷， 易于推广应用。
稳定性好
免疫胶体金技术稳定性好，试剂有效期长，可长时间保存，保证了检测结果的稳定性和可靠性。
《免疫胶体金技术》PPT课件
目 录
• 免疫胶体金技术概述 • 免疫胶体金技术的制备 • 免疫胶体金技术的特点与优势 • 免疫胶体金技术的应用实例 • 免疫胶体金技术的挑战与前景
01
免疫胶体金技术概述
定义与原理
总结词
简述免疫胶体金技术的定义和基本原理。
详细描述
免疫胶体金技术是一种基于胶体金标记的免疫分析方法，利用胶体金作为示踪标记物，结合抗原抗体反应进行检 测和定量分析。其原理基于抗原抗体反应的特异性和胶体金的颜色变化，实现对目标物质的快速、灵敏和可视化 检测。
组装质控线
在硝酸纤维素膜上固定另一种 抗原或抗体，形成质控线。
组装试剂条
将硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸 和吸水纸按顺序粘贴成试剂条
。
质量检测与控制
外观检查
观察试剂条是否平整、无破损、颜色均匀。
稳定性检测
在不同温度和湿度条件下存放试剂条，观察 其稳定性。
性能测试
通过与已知浓度的标准品进行对比，检测试 剂条的灵敏度和特异性。
历史与发展
总结词
概述免疫胶体金技术的发展历程和重要突破。
详细描述
免疫胶体金技术最早可追溯到20世纪70年代，随着科学家对胶体金和免疫学研究的深入，该技术逐渐 发展成熟。近年来，免疫胶体金技术不断取得突破，在临床诊断、生物安全检测、食品安全检测等领 域得到广泛应用。
免疫胶体金的技术
2. 凝胶过滤法
u 将探针溶液装入透析袋内， 4℃ ，置于硅胶或聚乙 二醇中浓缩至原体积的1 4～1 5 u 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 u 经Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。 用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脱 ? TBS的PH根据蛋白质种类而定 u 按红色深浅分管收集洗脱液
1. 光镜免疫金银法 3 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤 3 显影液的配制及显影过程应在暗处进行 3 阳性部位呈黑色颗粒状 32. 电镜免疫金银法 3 包埋前染色, 包埋后染色
【IGSS法优点】
1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高 3. 定位准确 4. 背景清晰, 对比度好 5. 方法简便, 安全 6. 成本较低, 标本可长期保存
【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等
柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15~150nm
白磷还原制备的金颗粒直径较小，3~12nm
【具体制备方法】
（二）影响溶胶稳定性的因素 u 电解质 u 胶体金浓度 u 温度 u 大分子物质
（三）胶体金的鉴定
【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小 及金颗粒的均匀程度
( 七) 标记探针的鉴定
1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴在覆有
Formavar膜( 支持膜) 的镍网上, 空气中干燥, 醋 酸铀负染, 透射电镜下观察
2. 生物活性鉴定: 可用直接或间接法放射免疫
测定, 凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定
四. 免疫胶体金染色方法
( 一 ) 免疫金染色法
Immunogold staining, IGS
( 五）标记
1. 计算所需待标记蛋白质的总量
根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最 适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量
胶体金技术及其应用
该42013年第09期二榷影妞却爵言注公目高二璃纤维的结合释放垫上其一端与膜相连相连膜的另一端连有吸水垫尿或其他体液后样品通过毛细管的扩散作用向前移动并通过含标记物的玻璃纤维使标记物重新水化并与胶体金标记物相互反应然后一起向前泳动至检测线固定有特异性抗原或抗体时标记物与待测物的复合物会被检测线截获而出现明显而直观的红色结果则会和游离标记物一起越过检测线到达质控线或试验终止线被截获而出现红色的对照结果或问接法检测抗体池有采用双孔间接法或反流免疫层析法检测i如和glm对于小分子抗原如药物残留定等来说则宜采用竞争抑制法胶体金快速检测技术的特点检测面广免疫胶体金技术既可用于抗原抗体检测也可用于体内生物活性物质检测等领域操作方便不论是胶体金免疫层析技术还是斑点免疫金渗滤技术都具有操作步骤简单无需特殊仪器殊处理作人员无特殊技能要求快捷迅速免疫胶体金快速诊断技术需时短要5口0币n就会出结果而其它方法如elisa需要1卫hpcr需要时间更长特异性强由于该技术大多用单克隆抗体标记定了它只对某一抗原决定簇进行检测因而具有很好的特异性灵敏准确由于试验条件的不断优化敏度都可达到检测中总体符合率均在95以上靠4石携带方便由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程碑吉合牢固定不受温度等外界因素影响河随身携带随时检测脸测结果也可长期保存安全环保与其它检测方法相比大简化了操作段有诸如放射性同位素质参与试验所以既不会损害操作者健康池不会污染环境具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性胶体金技术在兽医学中的应用在畜禽病毒病诊断中的应用扩大和畜禽疫病的复杂化对疫病的诊断及鉴别诊断要求不但要准确而且要求快速才能有效的做好防治工作病毒抗原检测技术的进步免疫胶体金技术以其快速可单份检测多等优点也开始被逐渐应用于畜禽病毒病的诊断目前利用胶体金技术制备的试纸在畜禽病毒病的诊断中发挥了重要的作用心法建立的猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条启可以用来另一端与样品垫quot
胶体金检测技术-
阳性结果 样品中可能含有等于或源自于3ng/ml的盐酸克伦特罗。培训资料
四、ß -激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍
以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例
一．适用范围： 主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊 尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要 5~10分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb)。也就是说当 尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml时，检测 卡才能检测到。
试纸条中的NC膜受潮后，尿样在上面无法正常泳动，无 法到达吸水纸的位置；胶金垫上的金标抗体受潮后会变性， 从而失去原有的生理性功能，影响抗原抗体的选择性反应。 因此，试纸条必须保持干燥，从包装袋中取出后要尽快使用。 3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹
尿样一开始在NC膜上泳动时，是利用毛细管作用，如果 风吹太阳晒，NC膜上的尿样蒸发后难以到达吸水纸的位置，会 产生假阳性结果，因此，检测时要避免阳光直射和电风扇、空 调的风直吹。
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二 、包装 每个包装袋中包含盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测卡 ，滴管1个、干燥剂1片。
三、现场筛查步骤
1. 在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将检测卡 和待检样本溶液恢复至室温。
2. 从原包装袋中取出检测卡，打开后请在一个小时内就地 使用。
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3．将检测卡平放，用移液器或滴管吸取尿液样品溶液，垂 直滴加3滴（约80ul）于加样孔中，加样后开始计时。
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图1 金颗粒示意 图
在溶液中金颗粒呈 圆形, 表面带有负电 荷 , 由于静电的排斥 力 , 使其在水中保稳 定状态，形成稳定 的胶体状态。
培训资料 3. 胶体金试纸条的构造
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一、胶体金的一般性状(一) 胶体金的颜色溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色、分散相物质的分散度和入射光线的种类，是散射光线还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。
对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同。
如胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红色的葡萄酒色；20～40nm之间的金溶胶主要吸收波长530nm的绿色光，溶液呈深红色；60nm的胶体金溶胶主要吸收波长600nm的橙黄色光，溶液呈蓝紫色。
一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5～60nm范围内，溶液呈现红色。
在相当的一段时期内保持其溶胶不变性，称为胶体金的稳定性。
影响其稳定性的因素主要是电解质，其次是胶体金本身的浓度、温度及其他非电解质等。
(二) 胶体金的稳定性溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散相之间，其颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。
然而，溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总面积较大、因在胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。
当胶体颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。
影响其稳定性的主要原因有三点。
(1) 胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶体颗粒合并而变大。
(2) 胶粒及其溶剂化层胶粒及其溶剂化层(溶剂是水时就是水化层)的带电情况。
一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。
同性电荷相斥，双电子层变厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。
(3) 胶体接口的溶剂膜当二个固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。
两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。
(三) 溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。
因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小，甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。
引起溶胶聚沉的原因有。
(1)少量电解质对溶胶的聚沉作用少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示。
聚沉值是在一定时间内使1L某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小物质的量(mm01)。
显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大。
聚沉值从实验中得出如下的规则：①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用；②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价增加而显著增加。
电解质能使溶胶聚沉是由于电解质与胶粒带相反电荷离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电子层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时，两个质粒间便可以更加接近，即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。
胶粒的双电子层结构图(2)温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大。
当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。
(3)浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。
二、胶体金制备前的准备制备胶体金的方法很多，其中应用较为广泛的是还原法，而分散法和其他凝聚法都不合乎要求。
还原法的基本原理是在氯化金溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。
在医学研究中最常用的还原剂有白磷、乙醇、过氧化氢、抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠及鞣酸等。
本节将重点介绍应用上述还原剂制备胶体金的具体方法和步骤，还可根据各实验室的条件及所需合成颗粒的大小，来选择合适的方法。
现将常用的几种方法介绍如下：①白磷还原法(Isigmondy，1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；②白磷还原法(1sigmondy 及IsigmondyThiessen，1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的金颗粒；③抗坏血酸还原法(Statis和Fabrikanos，1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒；④柠檬酸三钠还原法(Frens，1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；⑤乙醇—超声波还原法(Baigent和Muller，1980年)可合成6～10nm大小的金颗粒；⑥硼氢化钠还原法(Trchopp 等，1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒；⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(Slot等，1985年)可合成3～17nm大小的金颗粒。
作者实验室主要用单宁酸—柠檬酸三钠还原法、柠檬酸三钠还原法及硼氢化钠还原法，主要根据合成颗粒大小来选择。
(一)玻璃器皿的清洁还原法可以认为是重结晶过程，颗粒的大小取决于结晶核形成的速度及结晶核生长的速度。
因此，用于制备胶体金的玻璃器皿应绝对清洁。
因为玻璃表面性状对还原过程的启动有重要作用，少量的污染会影响胶体金的生成，造成颗粒大小不一或液体浑浊。
处理方法是将玻璃器皿清洁晾干后，人清洁液内浸泡24h，取出后依次用自来水和蒸馏水洗净，凉干，硅化，也可不经硅化。
第一次生成胶体金稳定玻璃器皿表面，然后弃去，再用蒸馏水洗后即可再用。
最好是所有的玻璃器皿专用化，以减少污染。
玻璃器皿表面应无明显的划痕，否则也会影响胶体颗粒的均一度。
(二)试剂的配制要求(1)配制试剂均用双蒸馏水或三蒸馏水，或用去离子水。
(2)氯化金水溶液的配制氯金酸(AuCl3·HCl)每支为1g装，用时用蒸馏水一次全部稀释成l％水溶液，呈现黄色的透明状，应无任何沉淀，未用完部分可保存在4℃冰箱内，长期使用。
(3)SPA纯晶、特异性抗体或第二抗体必须经亲和层析，琼脂免疫双扩散效价为1：64以上才可选用，其他蛋白及受体也需高度纯化。
(4)白磷或黄磷乙醚溶液的配制白磷在空气中易燃烧，操作时要小心。
把白磷放在蒸馏水中切成小块，放在滤纸上吸干水分后，迅速放入已准备好的乙醚中，轻轻摇动，等完全溶解后即得到饱和溶液，并贮藏于棕色密闭瓶内，阴凉处保存。
(5)其他试剂配制后最好用一定规格的超滤膜过滤，以去除大分子聚合物。
三、白磷还原法制备胶体金分散颗粒胶体金可用多种方法制备，其中应用较为广泛的是化学还原法。
这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子，可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但在生物医学领域内最为常用的还原剂是白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸等。
白磷还原法的建立已有近百年的历史，由于此法操作较为简便，制备出来的胶体金颗粒大小较一致，因而应用较为广泛，现以Faulk和Taylor(1971)的报道为基础介绍这一方法。
(1)取1％氯化金1.5mL、0.1mol／LK2CO3 1.2mL，加入120mL双蒸水。
(2)上述溶液充分搅拌混匀3min以上。
(3)在搅拌条件下将lmL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液加入上述混合液中，约在5min内溶液变为棕红色。
(4)将上述混合液加热煮沸，直至变成鲜明的橙红色为止，一般约需l0min。
橙红色的出现表明氯化金的还原反应终止，胶体金制备成功。
按上述法制备的金颗粒直径为(5.6土0.9)nm。
白磷还原法一般只能制备出单一颗粒直径的胶体金。
因此，用于电镜双重标记或多重标记时此法显得有些不足，还需结合其他方法。
Henegouwen等(1986)发展了传统的白磷还原法，可制备出多种不同直径的胶体金，取得了良好的效果，具体方法如下。
(1)取0.5mL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液，加入到60mL用上述方法制备的胶体金中(5.6nm土0.9nm)充分振摇5min以上。
(2)将1％氯化金0.75m1及0.1mol／LK2C030.6mL加到上述溶液内，振摇数分钟溶液变成棕红色。
(3)将上液煮沸加热，直至变成鲜明的红色，一般需l0min。
上述还原过程使胶体金颗粒直径增大，随着还原次数的增加，胶体金颗粒的直径亦越来越大，二者之间的关系见表。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系(白磷还原法)还原次数颗粒直径/nm SD0 16 0.91 6.7 0.92 7.9 0.94 9.8 1.35 12 1.0这一方法的特点是通过循环还原的引入使原白磷还原法的适用范围得到扩大，其次，在循环还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，而只与原先的金颗粒结合，使它直径变大。
原先加人的胶体金颗粒起着“晶核”的作用。
因此可以利用这一方法制备出一系列颗粒直径不同但具有相同颗粒密度的胶体金来。
四、柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒柠檬酸钠还原法(Frens，1973)制备过程十分简单，制备出的金颗粒均匀一致，因此广为采用。
取0．01％氯化金溶液l00mL加热至沸腾，迅速加入4mL 1％柠檬酸钠水溶液，可见溶液很快变蓝，然后继续加热至溶液由蓝变为橙红色为止。
通过改变柠檬酸钠的用量可以制得不同颗粒大小的胶体金，因而显得十分方便。
各种颗粒的胶体金制备详见表。
柠檬酸钠用量与胶体金颗粒直径的关系0.0l%氯化金用量/m 1%柠檬酸钠用量/mL 胶体金颗粒直径/nm50 2.00 10.050 1.50 15.050 1.00 16.050 0.75 24.550 0.50 41.050 0.30 71.550 0.21 97.550 0.16 147.0表并不表明按照Frens法只能制备出上述几种颗粒的胶体金，大量研究已表明该法制备胶体金时，颗粒的大小是柠檬酸钠用量的函数，即在一定的范围内任意给定一个柠檬酸钠的量，总有一定大小的胶体金颗粒与它相对应，因而这种方法可很好地满足电镜双重标记和多重标记的要求。
五、制备胶体金分散颗粒的其他方法（一）乙醇—超声波还原法(Baigent和Muller，1980)(1)取1％AuCl3·HCl水溶液lmL加入100mL双重蒸馏水。
(2)用0.2m01/LK2C03调pH至7.2，再加入lmL无水乙醇。
(3)用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，此法制备的颗粒为6-10nm。
硼氢化钠还原法(Tschopp等，1982)(1)取0.6mL 1％氯化金水溶液，加入40mL预冷(4℃) 双蒸馏水。
(2)再加入0.2mol/LK2C030．2mL。
(3)边搅拌边加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液(0.5mg/m1)2mL，至溶液由蓝紫色变为橙红色为止。
然后继续搅拌5min，获得的金颗粒直径在2-5nm之间。
（二）放射性胶体金制备法(Kent等，1981)(1)取0.01％AuCl3·HCl水溶液100mL，加热至沸腾。
(2)加入40ul195Au。
(3)迅速加入4mLl％柠檬酸三钠水溶液，搅拌5-7min，至出现透明的橙红色。