荧光免疫技术抗核抗体
免疫学检验技术—荧光免疫技术
荧光显微镜光路图
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
“++”：明亮
“+++”：耀眼
对照光：“-”或“±”
为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基 苯、I-等 。 * 荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；
消除非特异性荧光（本底）的干扰。
• Stokes位移 荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能
量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。 • 荧光偏振
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并 发出单一平面的偏振荧光的现象。
知识目标
教学目标
1.熟练掌握：荧光抗体的制备及荧光抗体技术（重难点）。
2.掌握：常用的荧光物质，时间分辨荧光免疫测定（重点）、荧光偏振免 疫测定。
3.了解：荧光的基本知识、免疫芯片技术。
能力目标
1.掌握：荧光抗体技术标本的制作。
2.学会：荧光抗体染色与结果判断。
思政-素质目标
责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
抗核抗体的检测方法
抗核抗体的检测方法
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA），就像侦探在寻找线索一样，能精准地检测出抗核抗体是否存在呢。
比如说，在检查血液的时候，它能火眼金睛般地把抗核抗体给揪出来！
2. 免疫荧光法呀，如同一个神奇的魔法镜，可以让抗核抗体现形哟！就好比如你在黑暗中寻找东西，它一下子就把光打在了目标上，厉害吧！比如医生用这个方法能清楚地看到抗核抗体的情况呢。
3. 免疫印迹法可牛了，它仿佛是个智能识别器，对抗核抗体的辨别那叫一个准！你想想看，这不就像是在一堆东西里一下子挑出你想要的那个，是不是很神奇呀！像诊断一些疾病的时候就经常用到它呢。
4. 胶体金法呀，就像是个小巧玲珑的指南针，能快速指引出抗核抗体的方向哦！比如说在一些快速检测中，它就发挥大作用啦！
5. 化学发光法，那简直就是夜空中最亮的星呀，一下子就能把抗核抗体照亮呢！举个例子，在检测的关键时刻，它能给出最闪亮的答案！
6. 间接免疫荧光法，相当于一个精准的瞄准器，能准确无误地锁定抗核抗体呢！就像射击比赛中瞄准靶心一样厉害哟！比如在复杂的情况中它也能发挥威力。
7. 斑点酶免疫技术，如同一个细心的卫士，能牢牢地守住检测抗核抗体的关卡呀！想想看，是不是很有安全感呢！比如在特定的检测情境下它可重要啦。
8. 流式细胞术，哇塞，这可是个高科技的玩意儿呀，能高效地检测抗核抗体呢！这就好比有一双特别的眼睛，能瞬间捕捉到关键信息，厉害吧！像一些精确的分析中就少不了它。
9. 放射免疫法，那可是个厉害的角色呢，对检测抗核抗体有着独特的本领哦！就好像拥有超级力量一样，能准确找到目标呢！比如在一些专业的检测领域就有它的用武之地啦。
我觉得这些抗核抗体的检测方法都各有特点和优势，在医学诊断中都起着至关重要的作用呢！。
荧光显微镜技术-抗核抗体检测2
对照设置：
1）标本自发荧光对照：
抗原片只中加缓冲液后观察，结果阴性。
2）荧光抗体对照：
抗原片只加荧光抗体染色，结果阴性。
四、结果观察
首先观察对照，再观察待测样本。
细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不
发荧光为阴性。阳性血清可进一步稀释后
测定效价。
荧光核型观察。
结果观察：
均质型 主要见于SLE
合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
二、主要试剂及器材
试剂：
FITC标记的抗人IgG抗体、缓冲甘油、
0.01mol/L pH7.2 PBS
器材： 荧光显微镜
三、操作方法
1.抗原片制作
固定
染色★ 37 ℃30min
3.荧光显微镜检查
★
2. 荧 光 抗 体 染 色 － 间 接 法
1．抗原片制作
荧光免疫显微技术 －抗核抗体检测
邓念华 检验医学院临床免疫学教研室
一、原 理
即采用间接法对自身抗体－抗核抗体（AN抗原片，将病
人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，
就会与细胞核成分特异性结合。
再加入荧光素标记的抗人IgG抗体再与ANA结 不同荧光核型对自身免疫性疾病有诊断意义。
原则：
2.荧光抗体染色－间接法
间接法原理示意图
1）处死小鼠取肝制作肝印片，用丙酮固定10min。 2）待测血清作用PBS作1:10稀释，加50ul于抗原 片上，37度温育30min。 3) 取出抗原片，用PBS冲洗，3次×3min/次。再 用双蒸水冲洗，冷风吹干。 4）滴加1:20的稀释FITC－抗人IgG抗体，37度温 育30min。 5）取出抗原片，用PBS冲洗，3次×3min/次。再 用双蒸水冲洗，冷风吹干。 6）滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。
抗核抗体核点型
抗核抗体核点型抗核抗体核点型是一种自身免疫性疾病，其特征是患者体内产生了抗核抗体，并在细胞核中出现核点样荧光。
本文将介绍抗核抗体核点型的定义、病因、临床表现、诊断和治疗等相关内容。
一、定义抗核抗体核点型是指抗核抗体通过免疫荧光方法检测时，在细胞核中出现核点样荧光。
这些核点样荧光通常与染色质颗粒或核仁相关。
二、病因抗核抗体核点型的发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、环境和免疫失调等因素有关。
研究发现，某些基因变异与抗核抗体核点型的易感性有关。
此外，感染、药物、放射线等也可能诱发该疾病的发生。
三、临床表现抗核抗体核点型的临床表现多样，常见症状包括疲劳、关节痛、发热、皮疹等。
部分患者还可能出现器官受损，如肾脏、心脏、肺等器官的损伤。
四、诊断抗核抗体核点型的诊断主要依靠免疫学检测，如间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等。
同时，还需结合病史、临床表现和其他相关检查结果进行综合分析。
五、治疗抗核抗体核点型的治疗目标是缓解症状、控制疾病进展，并改善患者的生活质量。
治疗方案包括药物治疗和非药物治疗。
药物治疗主要采用免疫抑制剂、激素和免疫球蛋白等，以控制免疫反应和减轻症状。
非药物治疗包括休息、合理饮食、积极治疗合并症等。
六、预后抗核抗体核点型的预后因个体差异而有所不同。
部分患者症状轻微，预后良好；而部分患者可能出现严重的器官损伤，导致预后较差。
因此，早期发现、早期治疗非常重要。
七、注意事项患者在接受治疗的同时，应注意避免诱发因素，如感染、暴晒、劳累等。
定期随访和检查也是非常重要的，以监测疾病的进展和调整治疗方案。
总结起来，抗核抗体核点型是一种自身免疫性疾病，其特征是在细胞核中出现核点样荧光。
该疾病的发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、环境和免疫失调等因素有关。
临床表现多样，诊断主要依靠免疫学检测。
治疗方案包括药物治疗和非药物治疗，预后因个体差异而不同。
患者在接受治疗的同时，应注意避免诱发因素，并定期随访和检查。
通过科学的诊断和合理的治疗，可以有效控制疾病的进展，改善患者的生活质量。
抗核抗体检测及临床意义LLL
抗核抗体检测及临床意义LLL抗核抗体（ANA）检测是一种用于检测人体血清中是否存在针对细胞核自身抗原的抗体的试验。
该检测主要用于系统性红斑狼疮（SLE）的诊断，但也常用于其他自身免疫性疾病的筛查和辅助诊断。
ANA检测是通过间接免疫荧光法进行的。
在该试验中，人体血清与细胞核自身抗原结合，形成免疫复合物，然后用荧光标记的二抗检测这些抗体的存在。
正常情况下，储存在细胞核内的抗原是隐蔽的，抗体不会结合。
而在自身免疫性疾病患者中，细胞核结构和组成发生了改变，使得抗原暴露在胞质中，即可触发产生ANA抗体。
ANA检测的结果以荧光染色的形式呈阳性或阴性。
阳性结果可以进一步进行亚型检测，包括抗dsDNA（双链脱氧核糖核酸）、抗Sm（Smith）抗体、抗Ro/La抗体等。
这些亚型的检测有助于进一步明确患者是否患有其中一种具体的自身免疫性疾病。
对于SLE患者，ANA检测的阳性率可以高达95%以上。
但需要指出的是，ANA检测并不能单独用于SLE的诊断，因为这种抗体在其他自身免疫性疾病和一部分非自身免疫性疾病中也可以出现阳性反应。
因此，ANA检测通常作为其他临床病征和实验室检查的辅助诊断指标。
除SLE外，其他一些自身免疫性疾病也可检测到ANA抗体。
例如，系统性硬化症、类风湿性关节炎和干燥综合征等疾病在临床上也存在ANA阳性的情况。
通过进一步检测抗体亚型，可有助于明确患者患病的特定类型和病情严重程度。
对于临床医生而言，ANA检测的结果常常与患者的病史、体征和其他实验室检查结果综合分析来进行诊断。
这些综合信息有助于明确患者是否存在自身免疫性疾病，并辅助制定治疗方案。
总的来说，抗核抗体（ANA）检测在自身免疫性疾病的诊断和辅助诊断中起着重要的作用。
通过检测患者血清中的ANA抗体，可以帮助医生进行早期诊断和治疗，提高患者的生活质量和预后。
然而，需要注意的是，ANA检测的结果仅仅是一个辅助指标，最终诊断应综合考虑病史、体征和其他实验室检查结果。
抗核抗体2分析解析
抗核抗体2分析解析ANA-2检测的意义在于检测抗核抗体的存在。
抗核抗体是一类针对细胞核内的成分产生的自身抗体。
在正常情况下，免疫系统应该只攻击感染的细胞或外来抗原，而不应攻击自身细胞。
然而，在一些自身免疫性疾病中，免疫系统会错误地攻击自身细胞，导致炎症和组织损伤。
ANA-2检测可以帮助诊断这些疾病，并指导治疗。
ANA-2检测通常使用间接免疫荧光法（IFA）进行。
在这种方法中，患者的血液样本与人类细胞进行反应，然后使用荧光染料观察结果。
在正常情况下，没有抗核抗体的存在，细胞核不会发光。
当存在抗核抗体时，细胞核会发光，这可能暗示自身免疫疾病的存在。
然而，ANA-2测试结果的解读并不是绝对的。
ANA-2阳性并不意味着一定存在自身免疫性疾病。
这是因为ANA-2可能在其他情况下也会出现阳性结果，比如感染性疾病、药物反应、癌症以及年龄和性别等因素的影响。
因此，阳性结果需要进一步的临床和实验室评估来确定是否存在自身免疫性疾病。
除了阳性结果，ANA-2测试还可以产生阴性或低滴度的结果。
这可能意味着不存在自身免疫疾病，或者疾病处于早期阶段，免疫系统尚未产生足够的抗体。
如果临床症状不符合ANA-2阴性的结果，可能需要多次测试来排除自身免疫性疾病的可能性。
在一些情况下，ANA-2测试可能显示不确定结果。
这意味着测试结果不明确，需要进一步的检查来确认诊断。
不确定结果可能是由于一些因素干扰了结果的解读，比如技术问题或测试中使用的细胞底物。
除了结果解读的复杂性外，ANA-2测试还存在一些其他的局限性。
首先，ANA-2并不是一种特异性检测，也就是说，阳性结果并不能明确指示其中一种自身免疫性疾病的存在，而且可能会出现假阳性。
其次，ANA-2测试无法预测疾病的严重程度或进展。
最后，ANA-2测试也无法用于监测治疗效果或预测疾病预后。
总结起来，ANA-2是一个重要的实验室检查工具，用于筛查和确诊自身免疫性疾病。
然而，测试结果的解读需要结合临床和其他实验室检查结果，以及评估可能的干扰因素。
医学知识之抗核抗体
抗核抗体抗核抗体(ANA)泛指抗各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。
ANA的性质主要是IgG，也有IgM和IgA，甚至IgD和IgE。
ANA可以与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。
ANA主要存在于血清中，也可存在于其他体液如滑膜液、胸水和尿液中。
ANA在SIE患者的滴度较高，但也出现在其他许多自身免疫病中，在许多研究报告中，都将检出ANA作为自身免疫甚至自身免疫病存在的依据。
这种现象的机制尚未明了，有待于进一步研究。
(一)ANA的类型及意义由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同;因此就会有多种不同的A NA。
1.抗核蛋白抗体核蛋白抗原(DNP)由DNA和组蛋白组成。
由于DNP抗原存在不溶性和可溶性两个部分，可分别产生相应的抗体。
不溶性DNP抗体通常不完全被DNA和组蛋白所吸收，它是形成狼疮细胞的因子;可溶性抗原存在于各种关节炎病人的滑膜液中，其相应抗体也出现于RA病人的滑膜液中。
2.抗DNA抗体可以分为两大类：①抗天然DNA(nDNA)抗体，或称抗双链DNA(dsDNA)抗体;②抗变性DNA抗体，或称抗单链DNA(ssDNA)抗体。
抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性，70%～90%的活动期SLE病人该抗体阳性，效价较高，并与病情有关。
抗s sDNA抗体可见于多种疾病中，特异性较差。
3.抗ENA抗体可提取性核抗原(ENA)多从动物的胸腺中提取。
先将胸腺匀浆并破碎细胞，分离出细胞核;再经盐水或磷酸盐缓冲液处理后，很容易从胞核中提取出来。
ENA不含DNA，对核糖核酸酶敏感。
近年来的研究表明，ENA可分为十几种，现仅介绍几种主要的ENA及其相应抗体。
(1)抗PNP抗体：PNA即核糖核蛋白，对核糖核酸酶和胰蛋白酶敏感，加热561h变性。
抗PNP抗体多见于混合性结缔组织病。
高效价的抗PNP抗体对混合性结缔组织病有诊断意义，而低效价的抗PNP抗体可在SIE患者中发现。
(2)抗Sm抗体：该抗体在一名Smith姓的患者血中首次发现，便以其名字的前两个字母命名。
间接免疫荧光法测ANA
间接免疫荧光法测ANA
第2页
ANA检测意义
有利于疾病诊疗 如抗Sm是SLE标识抗体； 抗ScL-70 是SD标识抗体； 抗Jo-1是PM/DM标识抗体；
观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理
间接免疫荧光法测ANA
第3页
【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
毒时，可于3％Sekusept Extra （汉高企业）
中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对
玻片进行标识。 间接免疫荧光法测ANA
第13页
试验步骤二：样品准备
1:100稀释血清标本。每次试验均 需加入阳性和阴性对照。对照血清 使用前必须混匀。
间接免疫荧光法测ANA
发荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，
不然为阴性。 阳性待检血清可作深入稀释后测定效价。
间接免疫荧光法测ANA
第23页
【均质型】 细胞核呈均匀一致荧光
间接免疫荧光法测ANA
第24页
【核仁型】 核仁部分展现荧光
间接免疫荧光法测ANA
第25页
【斑点型】(颗粒型) 细胞核内展现斑点状荧光
+
+
抗原
抗体（血清） 抗原—抗体
第二抗体
间接免疫荧光法测ANA
第7页
间接免疫荧光法测ANA
ANA筛选：间接免疫荧光法
第8页
试验原理：
✓生物薄膜载片上IgA、IgG、IgM类特 异性抗体能够与抗核抗原反应；随即 ，结合抗体可与标识荧光二抗进行反 应，并可在荧光显微镜下观察。
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包被组织切片的生物薄片 加样板
加25ul待测样本后盖板, 避免产生气泡
室温温育30分钟
浸洗至少5分钟
擦干生物薄片四周洗液
洗涤（先冲洗后浸泡）
PBSTween20
操作步骤
加样板上加入FITC标记 20ul二抗后，盖板
PBSTween20
荧光显微镜下观察结果
室温温育30分钟 洗涤（先冲洗后浸泡）
浸洗至少5分钟 擦干薄片四周洗液 石蜡(一小滴)封片
(勿用力挤压)
封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。 可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
注意事项
（1）试剂不经复温直接使用会降低反应温度，底物片凝 集水珠会影响反应效果，使用前要复温。
（2）标本稀释应准确，样本浓度过高或过低会造成假阳 性或假阴性结果。
（3）FITC标记的荧光二抗使用前需混匀。 （4）反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响
斑点型
特点：分裂间期：核质呈颗粒荧光（藕孔状） 分裂期：染色体部位无荧光（0型）
相关疾病：SLE、MCTD、SS等
核仁型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：硬皮病、皮肌炎等
周边型（核膜型）
特点：分裂间期：核周边荧光环增强 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：自身免疫性肝病
相关疾病：原发性胆汁性肝硬化
高尔基体型
特点：细胞核旁不规则帽状染色 相关疾病：SLE、SS
溶酶体型
特点：胞浆内油珠状染色 相关疾病：不明，中国人极罕见
中心粒型
特点：分裂期细胞中荧光点位于 细胞纵向对称的两极
相关疾病：不清
纺缍体型
特点：细胞分裂期对称纺缍型染色 相关疾病：不清
抗rings and rods(RR)抗体
核仁型： Scl-70、RNA多聚酶和原纤维蛋白ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 核点型： 着丝点、核点等
荧光免疫技术
抗核抗体（ANA）检测 间接免疫荧光法（IIF）
黄卓春
免疫学 检测方法
免疫沉淀法 免疫凝集法 酶免疫检测技术 荧光免疫技术 电化学发光技术 ……
共同的基础
抗原抗体 反应
检测方法 沉淀 凝集 显色 荧光 电子发光 ……
荧光免疫技术——抗原抗体反应与荧光标记技术 结合，对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测
抗核抗体的检测——间接免疫荧光法
荧光免疫技术 间接 荧光标记的二抗
直接法：
F
荧光标记的抗体
优点：步骤少
缺点：每种抗体都需
要标记荧光，不通用
F 间接法： 荧光标记的二抗 优点：通用荧光二抗 缺点：步骤多
抗核抗体的定义 抗核抗体的检测 抗核抗体的临床意义 抗核抗体检测策略 讨论要求
抗核抗体的定义
ANA（antinulear antibody）定义
细胞膜 细胞骨架蛋白
抗核抗体的检测
推荐采用以HEp-2细胞（Human Epithelial Cells,人 喉癌上皮细胞株）为底物的间接免疫荧光法 (Indirect ImmunoFluorescence assays, IIF)
优点：① HEp-2细胞形态大，细胞抗原种类齐全， 分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒） 等丰富（抗原齐全） ②IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体（形 态直观）
核点型
特点：细胞核部位分布大小较为 均匀的10个左右点状颗粒
相关疾病：自免肝病、系统性硬化
着丝点型
特点：分裂期大小数目大致相同的点状荧 光
相关疾病：局限性硬皮病
胞浆细颗粒型
特点：胞浆颗粒细且均匀，核仁 有染，疑为核糖体抗体
相关疾病：SLE
胞浆粗颗粒型
特点：胞浆颗粒粗且不均匀，核仁无染， 疑为线粒体抗体(M1~M10)
核糖体型 线粒体型 高尔基体型 溶酶体型 胞浆颗粒型
细胞骨架
肌动蛋白型 波形蛋白型 细胞角蛋白型 原肌球蛋白型 纽带蛋白型
细胞周期
中心粒型 纺缍体型
PCNA型
分离带型
占80%以上
注：核颗粒型又称核斑点型
ANA荧光染色模型实例
均质型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：浓缩染色
相关疾病：SLE、药物狼疮等
反应效果。 （5）洗涤步骤是影响检测结果最关键的一步，洗涤不充
分将会增加非特异染色，从而影响观察效果。
注意事项
（6）洗涤时先冲洗后浸泡，注意水流不要太急，不要直接对着 基质冲。
（7）擦板要小心，要分清正反面, 擦拭抗原板四周的液体要求小 心，不能碰到抗原板上包被地组织切片。
（8）盖片的时候，要将薄片上的凹孔对准加样板左边的小突起， 然后轻轻放下，见液滴完全浸泡住组织切片。
试剂与器材
➢ ANA检测试剂盒 包被组织切片的生物薄片（Hep2细胞、猴肝片） PH7.2 磷酸盐缓冲液/吐温20 标记FITC羊抗人二抗 阴性、阳性质控 石蜡（封片介质，PH8.4） ➢ 加样枪，试管，洗片槽，荧光显微镜
ANA检测原理和步骤
⑥ 荧光显微镜观察
⑤ 洗去多余荧光二抗
④ 加入荧光二抗反应
传统定义：是指抗细胞核抗原成分的自身抗体 狭义定义
现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指 一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称 广义定义
ANA细胞靶抗原成份模式图
分泌颗粒
中心粒
高尔基体 粗面内质网
滑面内质网
真核细胞
核仁
线粒体
核粒子
糖原颗粒
溶酶体
特点：分裂期、分裂间期细 胞胞质内、细胞核旁 可见圆形或棒状荧光， 细胞核阴性
相关疾病：丙肝，尤其是干 扰素或者利巴韦林治 疗后
ANA
根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：
核均质型： DNA、组蛋白和核小体等 核糖核蛋白：Sm、RNP、SS-A、SS-B
细胞核
斑点型 周边型：
Ku 细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型 板层素、gp210等
（9）封片时候将盖玻片放于加样板上，于相应的数字位置轻轻 点滴甘油，甘油的量不易过多，挤出后在其成滴落下前在玻 片上点滴。
（10）荧光染色后应尽可能及时观察， 不能及时观察应4℃避光 保存，以减少荧光淬灭。
IIF法检测ANA荧光染色模型
细胞核 细胞浆
均质型 颗粒型 核仁型 着丝点型 周边型 核点型
F
③ 洗去未反应血清蛋白
② 加入标本反应
自身抗体
非特异
F
蛋F白
① HEp-2细胞（底物片试剂盒） 检测过程 : 2 步反应 + 2步洗涤 + 1步观察
操作步骤
阴阳质控 不稀释 待测血清稀释100倍 20ul血清+2mlPBS 稀释液
生物薄片编号，如1,2,3
实验报告注明所加样本号 (如1-1,5051；1-2,5047)