网孔过滤法分离纯化肌源性干细胞
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞，对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作，在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议，希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本：干细胞的来源多种多样，可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时，需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时，注意样本的获取方式需要符合伦理规范，尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法：干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中，为了提取纯度较高的干细胞，需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等，选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化：提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增，为此，需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜，相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性：干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中，需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如，添加适量的抑制剂，调整培养基中的成分，以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备：在进行干细胞培养前，需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌，避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制：在干细胞的长期培养中，细胞传代是不可避免的。
然而，过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡，影响干细胞的生理状态和功能。
因此，需要控制细胞传代的次数，同时选择合适的传代方法，以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充：培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
网孔过滤法分离纯化肌源性干细胞
ｍｅ ｏ ，ｔｅ ｒｔｍｕｃｅ ｗ ｓｄｇｓｅ ｔ ｙ ｅ ＸＩ ｏｌ ｇ ｎ ａ ｄ ｔ ｐ ｉ ａ ｄ ｔ ｅ ｉｏａｅ ｅｌ ｓ ｓ ｅ ｓｏ ｓ ｐ ｒｆ ｄ ｂ ｈ ｈ ｔ ｄ ｈ ａ ｓｌ ａ ｉｅｔｄ ｗｉ ｔｐ ｃ ｌａ ｅ ｎ ｒ ｓｎ， ｎ ｈ ｓｌ ｔｄ ｃ ｌ ｕ ｐ ｎ ｉｎ ｗａ ｕ ｉ ｙ ｔｅ ｈ ｙ ｉ ｅ ｍｉ ｉｏ ｅ ｎ ｌｎ ｅ ｆ ｔｒ ｌ ｐ ｒ ｙｏ ｎ ｔ ｉ ｅ ．Ｔｈ ｒ ｌｅ ａｉｎ ａ ｉｉ ｏ ｌ ｌ ｅ ｐ ｉ ｒｔｏ ｂ ｌ ｙ ｆ ＭＤＳ ｒ ａｙ ｅ ｔｒ ｕ ｈ ｔｄ ｉｇ ｇ ｏ ｈ ｃ ｒ ｅ， ａ ｄ ｈ ｏ ｆ ｔ Ｃｓ ｗｅ ｅ ａ ｌｚ ｄ ｈ ｏ ｇ ｓｕ ｙｎ ｒｗｔ ｕ ｖ ｎ ｎ ｔｅ ｏ ｔｉｅ ｅｌ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ｔ ｅｌｉ ｂａｎ ｄ ｃ ｌ ｗｅｅ ｉ ｅ ｔ ｄ ｗｉ ｃ ｌ ｍｍｕ ｏ ｙｏ ｈ ｍｉａ ｅ ｈ ｉｕ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｓ ｌｔｄ ＭＤ ｌｔｃ ｎｑ ｅ． ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔｅ ｉｏａｅ ｈ Ｃｓ ｗｅｅ
骨骼肌 ， 网孔过滤纯化肌 源性千细胞后 ， 通过体外原代和传代培养， 经生长曲线、 细胞 融合 率等指标研 究肌源
性 干 细胞 的增 殖和 分化 能 力 ， 疫 细胞 化 学 染 色法进 行鉴 定 。结 果表 明 ： 免 通过上 述 方 法分 离得 到 小 圆形或 短 梭 形 的细胞 ， 疫细胞 化 学染 色 ｄｓｉ及 Ｃ 阳性 。说 明 网孔 过 滤法 可提 高肌 源性 干 细胞 的纯度 。 免 ｅｍｎ Ｄ为 关键 词 ： 源性干 细胞 ； 肌 微孔 尼龙 网 ； 外培养 ； 离纯化 ； 体 分 细胞传 代
Ｋｅ ｒ ｓ： ｓ ｌ ｅ ｖ ｄ ｓｅ ｃ ｌ ｙ ｗｏ ｄ Ｍｕ ｃｅ ｄ ｒ ｅ ｔｍ ｅ ｌ ｉ ｓ；Ｍｉ ｉｏ ｅ ｎ ｌｎ ｎ ｔ ｌ ｐ ｒ ｙｏ ｅ ；Ｃｕｔ ｒ ｎ ｖｔｏ； ｒ ｃ ｔｏ ｎ ｅ ｒ ｇ ｔｏ Ｐａ ｓ ｅ ｌ ｌｕ ｉ ｉ Ｐｕ ｉ ａｉｎ ａ ｄ ｓ ｇｅ ａｉｎ； ｓ ａ ｅ ｒ ｉ ｆ ｇ
生物制药工艺中深层过滤技术与应用
生物制药工艺中深层过滤技术与应用深层过滤技术是生物制药工艺中常用的一种分离和纯化方法，它能够有效去除悬浮物、微生物、细胞碎片和大分子杂质，同时保留目标蛋白等生物大分子的高纯度。
本文将介绍深层过滤技术的原理、应用以及在生物制药领域的重要性。
深层过滤技术原理：深层过滤技术是基于膜分离原理实现的。
通常使用多孔膜来构建过滤介质，这些膜具有精确的孔径大小，可实现对不同大小颗粒的筛选。
在深层过滤过程中，混合物被施加压力通过多孔膜，大分子和颗粒被截留在膜表面，而溶液则通过膜孔径，从而实现了目标物质的分离纯化。
深层过滤技术应用：1. 细胞分离和悬浮物去除：在生物制药中，发酵过程中产生的细胞和细胞碎片需要被有效地去除，以获得目标蛋白的纯化产物。
深层过滤技术可以用来去除细胞碎片、细胞脱落和细胞残渣等杂质，使得产物更加纯净。
2. 微生物和病毒去除：在生物制药工艺中，微生物和病毒是主要的污染源之一。
深层过滤技术可以有效去除微生物和病毒颗粒，降低产品的微生物污染风险，确保制品的安全性。
3. 大分子杂质的去除：生物制药中常常存在大分子杂质，如蛋白质聚集体和DNA碎片。
深层过滤技术可以通过控制膜的孔径大小，选择性地去除这些大分子杂质，从而提高产品的纯度和质量。
生物制药中深层过滤技术的重要性：深层过滤技术在生物制药工艺中扮演着重要的角色，其重要性主要表现在以下几个方面：1.提高产品纯度：深层过滤技术能够高效去除杂质和污染物，从而提高产品的纯度。
2. 改善产品的安全性：深层过滤技术可以有效去除微生物和病毒等潜在的致病源，降低产品受到细菌、病毒感染的风险，保障药品的安全性。
3. 提高产品稳定性：在生物制药过程中，一些大分子杂质如蛋白质聚集体和DNA碎片会影响产品的稳定性和活性。
深层过滤技术能够有效去除这些杂质，提高产品的稳定性，延长其保存期限。
4. 提高工艺效率：深层过滤技术操作简单，过程时间短，且适用于大规模生产。
它可以作为生物制药工艺中的一个关键步骤，快速去除大量的杂质和微生物，从而提高生产效率和产量。
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍在生物制药技术中，过滤与纯化是非常重要的步骤，它们用于从复杂的混合物中分离出所需的生物制剂。
这些技术可以帮助提高产品的纯度和质量，并且在制药工艺中起到关键作用。
本文将介绍生物制药技术中常见的过滤与纯化方法。
一、过滤方法1. 微滤：微滤是一种利用孔径大小为0.1-10微米的微细滤膜或滤器来分离溶液中的微小颗粒和悬浮物的方法。
该方法可以去除细胞碎片、细菌和大多数病毒等微生物颗粒，使溶液更加清澈透明。
微滤常用于前处理步骤，如澄清发酵液和细胞培养基。
2. 超滤：超滤是一种利用孔径大小为0.001-0.1微米的滤膜或滤器来分离分子和溶质的方法。
该方法可以去除分子量较大的蛋白质和多糖等大分子物质，同时保留较小分子物质。
超滤常用于蛋白质纯化、多糖提取和分离等步骤。
3. 离心过滤：离心过滤是利用旋转离心机产生离心力，将混合物中的固体颗粒或大分子物质沉淀到离心管或离心滤芯中的过滤方法。
离心过滤可以高效地去除悬浊物和颗粒，并可以在非常短的时间内完成分离过程。
它常用于快速蛋白质纯化、病毒颗粒提取等步骤。
二、纯化方法1. 亲和层析：亲和层析是一种基于生物分子之间特异性结合的分离纯化方法。
它利用靶分子（如抗体或配体）与某种特定的配对分子（如抗原或亲和剂）之间的亲和力进行选择性识别和分离。
亲和层析通常具有高选择性和高纯化效果，但对于大规模生产来说操作成本较高。
2. 杂交层析：杂交层析是一种依据目标物分子的细菌或细胞表面融合蛋白与其针对性抗体或配体间的亲和性进行分离纯化的方法。
这种方法可以通过调整条件，如洗脱缓冲液pH或盐浓度，来实现目标物的选择性吸附和洗脱。
杂交层析适用于大规模生产，并具有较低的成本。
3. 高效液相层析（HPLC）：高效液相层析是一种基于溶液相亲和性进行分离的方法。
它利用高压输送系统和特定的填料，将混合物中的分离物质通过不同的物理或化学性质将其分离出来。
HPLC可用于溶质的快速分离和纯化，广泛应用于生物制药领域。
细胞培养技术中的细胞纯化和分离
细胞培养技术中的细胞纯化和分离随着生物技术和生物医学研究的不断发展，细胞培养技术也越来越成为一种重要的研究手段。
在进行细胞培养实验时，不仅需要在培养基中提供适宜的营养条件，还需要考虑如何保证细胞的纯度和分离。
因为如果细胞混合在一起，可能会对实验结果产生干扰，影响科学研究成果的准确性。
细胞纯化和分离技术的发展，为细胞培养实验提供了有力的支持。
一、细胞纯化技术所谓细胞纯化，即是指将同一类型的细胞从混合物中分离出来，获得纯种的细胞。
这种技术应用广泛，例如在干细胞研究中，需要将干细胞从其他细胞中纯化出来。
目前常用的细胞纯化技术主要有以下几种。
1.差速离心这种方法的原理是依靠细胞的不同沉降速度，在其它细胞和细胞碎片中分离出要纯化的细胞种类。
比如对于混合的细胞，进行差速离心后，重的细胞如肝细胞等就可以在离心管的底部沉淀下来；而轻的细胞比如造血干/祖细胞则可以在上层沉淀。
这种方法虽然方便快捷，但是由于离心速度的不同，有时会把不同的细胞类型离心到一个位置，分离效果并不理想。
2. 细胞排序技术细胞排序技术是一种可接受的方法。
这种方法利用一种叫做细胞分选仪（FACS）的设备来实现，FACS通过运用激光束可以捕捉到被染色的细胞，然后在细胞上打标签，这样细胞分选仪就能帮助实验人员将目标细胞分选出来。
不仅如此，FACS还可以根据设定的特定标记，为不同细胞类型分类和分选。
但是，这种方法价格昂贵，需要训练技能，限制了它的使用。
二、细胞分离技术与细胞纯化技术不同，细胞分离技术是将混合物中的不同细胞种类分离的过程。
这种技术在体外培养单一细胞的物种和组织研究中应用广泛。
1. 磁珠细胞分离技术这种技术广泛应用在制备纯化细胞的过程中。
基本原理是通过对细胞标记来实现磁性分离。
首先，将细胞和磁性珠以特定的方式结合在一起，对此进行特别处理，这样可以使细胞在磁场中受到磁力吸引。
然后，将细胞和磁珠贴附在磁性离心离心机上，以达到将细胞分离的目的。
4种常用抗体分离纯化工艺介绍
4种常用抗体分离纯化工艺介绍抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。
纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。
纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。
大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。
下图中显示了一个常见的抗体纯化工艺。
反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，最后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
抗体分离纯化工艺其中最常用的四种纯化方法，也就是今天的主角“四大名捕”。
我们接着往下看吧。
1、Protein A从原核金黄色葡萄球菌细胞壁分离的结合受体Protein A(~56kDa)与不同免疫球蛋白同型的Fc区以及人VH3家族的Fab区具有高度的亲缘关系。
进一步研究表明，Protein A仅限于与IgG亚类IgG1、IgG2和IgG4结合，与IgG3的反应性很低，约占总IgG的8%。
天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域，结构示意图如下：Protein A的结构域示意图此结构的Protein A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A 的基因并进行改造，得到重组型Protein A，其非特异性结合明显降低。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景，被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞，研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法，适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下：1. 细胞准备：收集组织样品，将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制：根据所需提取的干细胞类型，选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养基中并进行培养，在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离：通过倒置显微镜观察，使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化：将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化，去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法，利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下：1. 细胞样品准备：提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记：将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合，可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选：使用流式细胞术仪器进行细胞分选，根据标记物的不同发射光强度，将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化：将目标干细胞从其他细胞中纯化出来，根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法，可在单个细胞层面进行分析，帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下：1. 单细胞捕获：通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解：采用细胞裂解酶对细胞进行裂解，释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增：使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备：将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备，包括文库构建、PCR扩增等步骤。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
干细胞提取和分离方法总结
干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。
目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。
干细胞的提取和培养方法介绍
干细胞的提取和培养方法介绍干细胞被广泛认为是生物学领域内最具潜力的研究对象之一，因其具备自我更新和多能分化的能力而备受科学家关注。
为了更好地理解干细胞在生物体内的作用和应用其潜力进行研究，有效的提取和培养方法是至关重要的。
本文将介绍几种常见的干细胞提取和培养方法，包括胚胎干细胞（ESC）、诱导性多能干细胞（iPSC）、成体干细胞和间充质干细胞。
胚胎干细胞（ESC）是最早被发现的一类干细胞，具有自我更新以及多能分化的特性。
提取ESC的方法通常是通过将内细胞团从早期胚胎中分离出来并将其培养在基质上，如鹅卵石胎盘或凝胶基质中。
内细胞团是胚胎早期形成的一层细胞，可以发展成各种不同类型的细胞，如肌肉、神经和心脏细胞。
随着科学技术的进步，科学家发现可以通过重新编程细胞来生成诱导性多能干细胞（iPSC）。
iPSC具有和胚胎干细胞相似的自我更新能力和多能分化能力，但不需要从胚胎中获得。
iPSC的提取方法主要包括细胞重新编程，即通过转导特定的基因或使用李斯特病毒进行基因转移，将成体细胞重新编程为干细胞。
成体干细胞是体内已分化的特定组织或器官中存在的干细胞。
这些干细胞具有自我更新和有限的分化能力。
成体干细胞可以从多种来源中提取，例如骨髓、脂肪组织和肌肉组织。
提取成体干细胞的方法通常是通过穿刺或手术获取组织样本，然后分离和培养出其中的干细胞群。
间充质干细胞是一类存在于成体组织中的多潜能干细胞，可以分化为多种类型的细胞，如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
间充质干细胞主要存在于骨髓、脐带血和脂肪组织中。
提取间充质干细胞的方法主要通过采用骨髓穿刺、脂肪组织切割或脐带血采集等操作，然后将提取到的细胞进行培养和扩增。
无论是胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞还是间充质干细胞，提取和培养方法都需要遵循一些基本原则。
首先，细胞提取过程应该尽量避免对细胞的损伤，以确保细胞的完整性和功能。
其次，培养环境应提供适当的营养物质、生长因子和细胞外基质，以促进干细胞的增殖和分化。
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网孔过滤法分离纯化肌源性干细胞作者：张雪，张风河，李纾，吴修胤【摘要】探讨乳大鼠肌源性干细胞的体外培养及纯化分离方法。
采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化乳大鼠骨骼肌，网孔过滤纯化肌源性干细胞后，通过体外原代和传代培养，经生长曲线、细胞融合率等指标研究肌源性干细胞的增殖和分化能力，免疫细胞化学染色法进行鉴定。
结果表明：通过上述方法分离得到小圆形或短梭形的细胞，免疫细胞化学染色desmin及CD34为阳性。
说明网孔过滤法可提高肌源性干细胞的纯度。
【关键词】肌源性干细胞；微孔尼龙网；体外培养；分离纯化；细胞传代Abstract：To establish the methods for culture，purification and segregation of rat muscle-derived stem cells in vitro.By two-step method, the rat muscle was digested with type Ⅺ collagen and trypsin，and the isolated cell suspension was purified by the millipore nylon net filter. The proliferation ability of MDSCs were analyzed through studying growth curve, and the obtained cells were identified with cell immunocytochemical technique.The results showed that the isolated MDSCs were small-cycloid or short-fusiform-shaped. They showed desmin(+) and CD34(+) by cell immunocytochemical technique. It proves that the method can improve thepurification of the MDSCs through the millipore nylon net filters.Key words：Muscle derived stem cells; Millipore nylon net; Culture in vitro;Purification and segregation;Passage1 引言近年在骨骼肌中发现了一群被称为肌源性干细胞（muscle-derived stem cells, MDSCs）的细胞群体，它具有良好的自我更新和增值能力及多项分化潜能，在适当的环境条件中可分化为骨骼肌细胞、血细胞、成骨细胞、内皮细胞、神经细胞［1-2］等。
因此，在细胞分子生物学研究中培养高纯度的肌源性干细胞非常重要。
2 材料和方法2.1 材料和试剂新生Wistar大鼠20只，购自山东大学西校区动物中心。
Ⅺ型胶原酶、多聚赖氨酸(Sigma公司)；Dispase (Gibco公司)、胰酶(Hyclone 公司)、DMEM培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(杭州赛乐公司)、马血清(Hyclone公司)、小鼠抗大鼠desmin、SABC试剂盒及DAB试剂盒购于武汉博士德公司。
微孔尼龙过滤网11 um,20 um,30 um,41 um。
2.2 骨骼肌细胞的消化选择健康的新生(3天以内)Wistar大鼠，将其置于75%酒精中5 min，无菌条件下切取其四肢肌肉，在外科显微镜下剔除肌肉表面筋膜及血管，含抗生素液的D-Hanks液冲洗3次（抗生素液为：青霉素1 000 U/ml、链霉素1 000 U/ml）,移入培养皿中，用显微外科剪标本为0.5mm3左右的小块，移入离心管中，加入培养液，静止3 min，去掉上层漂浮组织，0.1%Ⅺ型胶原酶消化30 min，加DMEM培养液离心（1 000转/min）3次，弃上清。
0.25%胰蛋白酶消化1 h,加含20%胎牛血清的培养液终止消化,依次滤过100目、200目、400目不锈钢网，滤液离心5 min（1 000转/min），分别用含20%胎牛血清（生长培养基）和2％胎牛血清（分化培养基）的培养液重新悬浮细胞PP0。
2.3 网孔过滤法进行分离纯化2.3.1 过滤细胞将圆形过滤网对折两次，打开呈漏斗状，距离圆周边缘5～10 mm，将滤网三折处用U形钉固定,95%酒精至少浸泡2～3 h，过滤细胞之前将过滤网上的酒精挥发或用PBS将其冲洗干净。
滤网置于50 ml的锥形管上，并放置于50 ml的离心管。
配置细胞悬液:将酶消化后的细胞悬液PP0制成单位悬液，1U=(3-5)×106cells/10ml。
用移液管将细胞悬液移入，移液管尖部位于离心管与锥形管接触点的下方。
开始滴加细胞悬液时，要缓慢地将细胞悬液滴入漏斗底部，2～3滴/s，因重力细胞悬液通过滤网。
随着大部分细胞悬液的通过，过滤速度越来越慢，为了使尽可能多的细胞顺利通过，用钳状骨针提起滤网边缘并轻轻振动，加快剩余细胞悬液的滤过。
2.3.2 收集细胞去除U型钉，打开滤网，通过强烈的振动，将未通过滤网的细胞尽可能多的释放于组织培养基中。
收集每一次细胞悬液通过滤网后的残留细胞。
最后，用无菌钳状骨针将滤网底部提起，无菌剪刀将未接触细胞悬液的滤网剪掉，剩余滤网放置于含有30～40 ml新鲜培养基的50 ml锥形管中，充分振动使细胞与滤网分离。
将所有分离细胞移入培养皿中继续培养，传代，鉴定。
2.4 细胞生长曲线测定将第2代细胞分别制备单细胞悬，分别消化后，以104/孔接种于24孔培养板中。
每组每天取3孔消化后，进行细胞记数，共7天。
根据记数结果绘制细胞生长曲线。
以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘在坐标纸上。
2.5 细胞融合情况的观察取生长状态良好的第2代骨骼肌源性干细胞，分别消化后，以105/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基进行培养。
共14孔，每7孔为一组。
待细胞分裂、增殖至80％汇合后，一组加入生长培养基（含20%FBS的DMEM），另一组加入分化培养基（含2%FBS 的DMEM）继续培养。
每天各组取一孔，将盖玻片进行 HE 染色后，光镜下观察细胞形态的动态变化，计算细胞融合率（细胞融合率=融合到多核细胞内的细胞核数 / 总细胞核数）。
2.6 免疫细胞化学法鉴定收集第2代细胞球，在预先包被L-多聚赖氨酸的盖玻片上作涂片，按试剂盒方法分别进行desmin、CD34荧光免疫法试验。
显微镜下观察，照相。
3 结果3.1 细胞形态MDSCs原代培养的肌源性干细胞依次通过11 um、20 um、30 um、41 um的滤网过滤后，刚开始贴壁时细胞形态为圆球形，完全贴壁后细胞形态呈纺锤形、梭形(见图1)；传代培养的肌源性干细胞呈不规则形(见图2)。
3.2 细胞生长曲线自第2天开始，细胞就进入对数生长期，第5天后由于接触抑制，增殖速度减慢，逐步达到平台期（见图3）。
3.3 细胞融合情况的观察MDSCs在分化培养基作用下，细胞间发生融合、形成肌管的能力明显增强（见表1）。
肌管为光滑长表1 不同培养条件下MDSCs的融合率（％）注：*与生长培养基组比较，有显著性差异（P＜0.01）条形，许多细胞核聚集在一起，位于肌管的中央，形成核链，肌管间多呈平行排列（见图4）。
3.4 细胞鉴定免疫细胞化学显示，结蛋白（desmin）及CD34在骨骼肌源干细胞中呈阳性表达（见图5）。
4 讨论MDSCs是近年来研究的热点，实验研究方法也是目前科研人员讨论的重点。
正常情况下，MDSCs在肌肉中数量很少，不论采用差速贴壁法［3］、梯度离心法，还是流式细胞仪，细胞分离过程中都会对本身就很少的MDSCs进一步造成损失。
本实验将细胞悬液PP0通过四种直径不同的尼龙微孔过滤网过滤,可将直径小的细胞过滤分离出来，然后再进行培养，得到纯度较高的MDSCs。
这种实验方法是利用MDSCs直径较大，以及微重力原理进行的，另外此试验操作较为简单，得到的细胞具有较高的数量和质量，对细胞本身形态及特性的损伤非常小。
肌管形成是MDSCs分化的标志，除形态上的变化外，部分骨骼肌特异性蛋白的合成与表达也是分化的重要标志，可将此作为MDSCs的鉴定指标。
结蛋白desmin是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一，是较早表达的肌源性标志蛋白，是目前公认的成肌分化的早期标志物［4］，在MDSCs中，desmin阳性率可达90％，由此可以进行初步鉴别。
另一个潜在的鉴定肌源性干细胞的标记物是CD34［5］，研究认为CD34的表达限于毛细血管内皮细胞、造血前体细胞和骨髓中的间质细胞前体，被确定为干细胞的标记物。
MDSCs来源广泛，取材方便，容易分离培养和体外扩充增殖且易于外源基因的导入和表达，使用安全，自体移植又克服了伦理学争议和排斥反应等问题，将为临床众多疾病包括骨缺损修复、肌萎缩、心肌梗死、压力性尿失禁等的治疗带来新的希望，还可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体，是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子［6-7］。
本实验在以往实验的基础上，通过微孔过滤法获得纯度较高的MDSCs,为种子细胞的广泛应用提供了良好的条件。
【参考文献】［1］Sarig R, Baruchi Z, et al. Regeneration and transdifferentiation potential of muscle-derived stem cells propagated as myospheres［J］. Stem Cells，2006，24(7):1769-1778.［2］Hans R, Popa V, Murry CE, et al. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes aftercardiac grafting ［J］. Mol Cell Cardiol, 2002, 34: 241-249.［3］Jankowski RJ, Haluszczak C, Trucco M, et al. Flow cytometric characterization of myogenic cell population obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem- cells ［J］. Hum Gene Ther，2001，12 (6):619-628.［4］Hwang JH, Yuk SH, Lee JH, et al. Differentiation of stem cells isolated from rat smooth muscle［J］. Mol Cells, 2004, 17:381.［5］Deasy BM, Gharaibeh BM, Pollett JB, et al. Long-term self-re-newel of postnatal muscle-derived stem cells［J］. Mol Biol Cell, 2005, 16 (7): 3323-3333.［6］Arsic N, Mamaeva D. Lamb NJ, Fermandez A, et al. Muscle-derived stem cells isolated as non-adherent population give rise to cardiac, skeletal muscle and neural lineages ［J］. Exp Cell Res, 2008, 314(6):1266-1280.［7］Lee JY，Cannon TW，Pruchnic R，et a1．The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence［J］. Int Urogynecol，2003，14：31-37．。