生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药名词解释
生物技术制药名词解释生物技术制药是指利用生物技术手段，通过改变细胞或生物体的遗传物质，以生产药物或医疗产品的过程。
这一领域的发展已经取得了巨大的成就，为医疗行业带来了革命性的变革。
以下是一些与生物技术制药相关的名词解释。
1. 生物技术。
生物技术是指利用生物体、细胞或其组分进行实验室操作的一系列技术。
这些技术包括基因工程、细胞培养、蛋白质纯化等，可用于生产药物、治疗疾病、改良农作物等领域。
2. 基因工程。
基因工程是通过改变生物体的遗传物质，来产生特定的性状或产物。
这一技术在生物技术制药中被广泛应用，用于生产重组蛋白、激素、疫苗等药物。
3. 重组蛋白。
重组蛋白是指利用基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中，使其产生特定的蛋白质。
这些蛋白质常被用作药物，如重组人胰岛素、重组干扰素等。
4. 生物制药。
生物制药是指利用生物技术手段生产的药物。
与传统化学合成药物相比，生物制药具有更高的特异性和生物相容性，通常用于治疗癌症、糖尿病、风湿性关节炎等疾病。
5. 生物仿制药。
生物仿制药是指在原研药品专利到期后，其他公司生产的与原研药相似的生物制药产品。
生物仿制药的研发需要严格的生物等效性评价，以确保其与原研药在安全性和有效性上的一致性。
6. 基因治疗。
基因治疗是利用基因工程技术，将外源基因导入到患者体内，以治疗遗传性疾病或其他疾病的一种新型治疗方法。
虽然目前仍处于研究阶段，但基因治疗被认为具有巨大的潜力。
7. 细胞培养。
细胞培养是将动植物细胞在无菌条件下培养、增殖、传代的过程。
这一技术在生物技术制药中被广泛应用，用于生产细胞因子、单克隆抗体等生物制药产品。
8. 单克隆抗体。
单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
单克隆抗体被广泛应用于肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗等领域。
9. 疫苗。
疫苗是一种预防性的生物制品，通过激活机体的免疫系统，产生特定的抗体或细胞免疫应答，以预防传染病的发生。
生物技术制药中的疫苗包括重组疫苗、DNA疫苗等。
生物技术制药重点整理
一．名词解释1.生物药物:指从生物体、生物组织、细胞、体液等，利用物理、化学、生物技术等原理和方法方法制造一类用于预防、治疗和诊断的制品2.悬浮培养:培养细胞的生长不依赖支持物的表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。
3.双功能抗体:它是非天然抗体，结合抗原的两个臂具有不同的特异性。
4.补料分批培养:将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间接或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。
5.单克隆抗体:是将抗体产生B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合所产生的抗体。
6.质粒的分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象7.基因表达:指细胞在生命过程中，将储存在DNA中的遗传物质经过转录与翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子8.连续培养:将种子接入发酵反应器中，培养至一定菌体浓度后，进行不间断的培养9.酶工程是:酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的新学科。
从应用目的出发研究酶的、应用酶的特异催化功能并通过工程华东将原料转变为有用物质的技术。
固定化培养：将固定化技术应用基因工程菌的连续培养中，以提高治理的稳定性。
10.连续发酵：发酵过程中，一边补入新鲜的料液，一边放出等量的发酵液，使发酵罐中的体积保持不变。
特点：达到稳定后，菌体的浓度、产物的浓度、限制性基质的浓度都是恒定的，不随时间发生改变11.分批发酵：在封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式特点：一次性投料，，在发酵过程中不再补料，直到放罐。
整个过程中，菌体浓度、产物浓度随时间的变化而变化12.补料分批发酵：在分批发酵的基础上，间歇或连续的补加新鲜的培养基的一种发酵方式特点：1)在二次或多次补入新鲜的料液，延长产物的合成周期，提高产量；2）只有料液的加入，没有发酵液的放出。
因此发酵结束时，体积比考试的时候有所增加13.半连续发酵：在补料分批发酵的基础上，间歇放掉一部分发酵液特点：放掉部分发酵液，再补加新鲜的料液，有利于有害物质的稀释，有利于产物的合成，提高产量14．原生质体融合：用脱壁酶脱去细胞的细胞壁，变成原生质体，再用聚乙二醇促进原生质体的相互融合，形成异核体的活重组子的技术15.诱变剂：能诱发基因发生突变并使突变率超过自发突变水平的物理化学因子16.发酵工程：利用微生物制造工业原料或工业产品17.诱变育种：利用物理或化学的因素，人工诱发基因的突变，筛选高产菌种的过程18.生物技术制药：利用现代生物技术可以人为地创造一些条件，借助微生物、动物或植物生产所需的医药品19.生物技术药物：采用DNA重组技术或其他新技术研制的蛋白质或核酸类药物20.嵌合抗体：由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因嵌合，然后插入到载体中，转染骨髓瘤细胞表达的抗体分子21.交联法：用双功能或多功能试剂，将酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法二．简答题1.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体结合位点的有效性③SD序列和起始密码A TG的间距④密码子组成⑶表达产物的稳定性⑷细胞的代谢负荷2.简述单克隆抗体的制备过程将产生抗体的B淋巴细胞与多发性的骨髓瘤细胞发生融合，产生具有两亲代细胞特征的杂交瘤细胞，将（大量培养能产生抗体的）杂交瘤细胞注入至小鼠的腹腔内，分离小鼠的腹腔抗体3.制备基因工程药物的一般程序？参考答案：获取目的基因，构建重组质粒，组建工程菌，培养工程菌，产物的分离纯化，除菌过滤，半成品检定，成品检定，包装4．发酵的基本过程菌种——种子制备——发酵液的预处理——提取精制1）用作培养菌种、扩大生产的发酵罐、培养基的配制2）对发酵罐、培养基以及辅助发酵的设备进行消毒杀菌3）将已培养好的具有生物活性的纯菌株转接到发酵罐中4）将接种到发酵罐中的菌株控制在适宜的条件下生长并产生代谢产物5）提取并精制，以得到合格的产品6）回收或处理发酵过程中产生的废物或废水5．微生物的发酵方式：分批发酵（在封闭的发酵系统内具有初始限制量的培养基质的一种发酵方式。
生物技术制药名词解释
.生物技术制药：采用现代生物技术，可以人为创造一些条件，借助某些微生物、植物和动物来生产所需要的药品目的基因：对目的基因中某个基因进行克隆扩增，获得该基因的研究或者应用，我们称该基因为目的基因基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有的加工过程，基因表达在各个水平的竞争，是由各个基因相互竞争共同的前提，以及催化结构的结果补料分批培养：将种子接入发酵罐中培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法悬浮培养：即让细胞自由悬浮于培养基内生长增殖，它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞贴壁培养：是必须让细胞贴附于某种基质上生长增殖的培养方法，它适用于一切贴附依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞单克隆抗体：将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系，此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高纯度抗体，这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体改形抗体：用鼠源性的单克隆抗体的CDR系列替换人的Ig分子中的CDR系列则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性抗体分子中的鼠源部分只占很小比例可基本消除免役原性，这种改形抗体又称为CDR移植抗体单链抗体：是由一段弹性链接肽，把抗体可变区重链（V H）与轻链（V L）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位诱导子：是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应，亦称抗性反应或自身防御反应的因子固定化酶：指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指用物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失，即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，制备固定化酶的过程称为酶的固定化交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法分子印迹：指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程，这个特定化合物叫印迹分子或模板分子脱分化：已经分化的细胞、组织和器官，在人工培养条件下又变成未分化的细胞和组织的过程消化分离法先从生物体取下组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞荧光抗体用荧光色素，如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红素等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体两步培养法第一步使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基，第二部采用适合于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。
生物技术制药重点总结
1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。
2.生物技术药物：采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。
3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。
分三种构型：共价闭合环状DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。
在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。
5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性的扩增DNA。
在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。
6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。
cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。
7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。
②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。
生物技术制药课堂重点
第一章绪论·生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。
·生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。
是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。
·生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。
·生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。
·现代生物技术的主要内容基因工程技术细胞工程技术酶工程技术发酵工程技术·生物技术制药的主要内容基因工程制药细胞工程制药酶工程制药发酵工程制药·基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。
·细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。
·酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。
·发酵工程技术：培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。
（抗生素、氨基酸、维生素）·生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。
第二章基因工程制药·基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。
·基因工程药物制造步骤:上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。
下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。
·分离纯化的步骤：细胞分离-细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工·基因重组蛋白的主要分离技术：分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜分离、双水相萃取。
生物制药名词解释
生物制药名词解释
生物制药是利用生物技术制造药物的一种方法。
它是通过利用生物体（如细菌、真菌、动物细胞等）来表达和产生药物分子的技术过程。
以下是一些常见的生物制药名词解释：
1. 生物技术：应用生物学、化学、工程学等相关学科的知识和技术，利用生物体、细胞、酶等进行制药和生产的方法。
2. 重组蛋白：通过基因工程技术将不同物种的基因组合在一起，使得生物体可以表达出新的蛋白质。
3. 基因工程：利用分子生物学技术，将外源基因导入到目标细胞中，使其表达出特定的蛋白质。
4. 重组DNA技术：利用DNA技术将目标基因与载体DNA连接，形成重组DNA，然后将其导入到宿主细胞中进行表达。
5. 表达系统：指用于表达目标基因并产生蛋白质的细胞或生物体。
6. 细胞培养：将细胞放入含有适当培养基的培养皿中，提供必需的营养物质和环境条件，使其在体外进行生长和繁殖。
7. 发酵：利用微生物（如细菌、真菌等）在适当的培养条件下，产生目标物质的生物过程。
8. 重组疫苗：通过基因工程技术将病原体的基因片段导入宿主细胞表达，从而产生一种可以诱导免疫系统产生免疫应答的疫苗。
9. 单克隆抗体：由单个细胞分离出来的一种特定抗体，可用于
治疗某些疾病或用于实验室研究。
10. 生物合成：利用生物体内的代谢途径和酶的作用，通过化学反应合成目标化合物。
这些名词解释提供了一些关于生物制药的基本概念和技术。
生物制药在医药领域中发挥着重要的作用，为人类疾病的治疗和预防提供了新的途径。
生物技术制药复习重点
生物技术制药重点一、名解1、载体：携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，主要有粒载体和入噬菌甾体。
2、铁壁培养：大多数动物细胞进行培养时需要贴附因子，内细胞自身分泌或认为在培养基中加入，使细胞在支持物表面贴附伸展和生长繁殖的培养方法。
3、基因工程制造：利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养以获得蛋白质药物的过程。
4、人鼠嵌合抗体：利用DNA重组技术，将鼠抗体轻、重链可变区基因插入含有人体抗体恒定的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体。
5、转化细胞系：正常的细胞经过某个轻化过程，失去正常细胞的转点而获得无限增殖的能力，得到的细胞系称为轻化细胞系。
6、离子交换层析：利用蛋白质等电点的差异来实现不同蛋白质间的分离和纯化。
7、生物技术制药：指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程等生物技术来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。
8、人源化抗体：CDR移植即把鼠抗体的CDR移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。
9、前体：在药物的生物合成过程中，被菌体直接用于药物合成而自身结构无显著改变的物质。
10、接种量：移种的种子液体和接种后发酵罐培养夜体积之比。
11、次级代谢产物：微生物从合成代谢的中间产物出发合成一些生理功能不明确，化学结构特殊，且对细胞生命并非必须的产物。
12、固定化酶，是将具有一定的胜利功能的酶或生物细胞，用物理或化学方法将其固定，作用固定生物催化而加以利用的一种技术。
13、凝胶过滤层析：凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维结构的多孔网状物质，当样品随流动相经过凝胶柱时大分子不能进入凝胶微孔而被洗脱出来，小分子能进入微孔流出速度慢，从而实现分离纯化的目的。
二、问答题1、疏水层析的原理是什么？需要进行几步操作？洗脱顺序是什么？答：原理：利用蛋白质分子表面上的疏水区域（非极性氨基酸残基的侧链）和介质的疏水基因之间的相互作用。
生物技术制药(第三版,夏焕章)复习重点
1.绪论1.1首次代表性药物——第一个动物疫苗药（美—基因工程药—DNA重组技术生产—1982欧洲被批用）：重组人胰岛素1.2（名词解释1）生物技术药物：采用DNA重组技术/其他生物新技术研制的蛋白质/核酸药物。
（包括——细胞因子、重组蛋白质药物、抗体、疫苗、寡苷酸药物…….）生物技术制药：以生物体、组织、细胞等为原料，利用物理、化学、生物化学、生物技术、微生物学、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
生物技术制药特性/特点：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益2.基因工程制药2.1基因工程技术的优点：①大量生产，为临床使用建立有效的保障。
②提供足够数量的生理活性物质③挖掘更多内源生理活性物质④获得新型化合物，扩大药物筛选来源2.2什么叫基因工程药（技术）？将目的基因插入载体、拼接、转入新宿主细胞，构建工程菌/细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程：将外源基因经体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
2.3工作流程上游——（实验室）——分离目的基因，构建工程菌/细胞下游——（实验室产品产业化）——（大规模培养）产品分离纯化，质量控制等2.4目的基因获得——反转录法（制取真核生物目的基因常用方法）①mRNA纯化——得到目的基因的mRNA特点：真核细胞中mRNA的3’端常含有一多聚腺苷酸polyA②cDNA第一链合成模板：蛋白质真核细胞的mRNA；反转录酶作用下，合成互补的DNA③cDNA第二链合成模板：cDNA（只反映基因表达转录及加工后产物携带信息—只与基因编码序列相关，不含内含子）反转录酶/DNA聚合酶1/Klenow酶大片段作用下，最终合成双链DNA序列得蛋白质多肽的DNA序列④cDNA克隆载体：质粒DNA/噬菌体DNA连接方法：加同聚尾；加人工接头⑤重组体导入宿主细胞⑥cDNA文库鉴定——表型筛选⑦目的cDNA克隆的分离与鉴定方法：核酸探针杂交法；免疫反应鉴定法2.5基因表达①常用宿主菌细胞及优缺点（目前最常用——大肠杆菌、酿酒酵母）1）原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉素-可糖基化）P222）真核细胞（酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞）优点：可糖基化缺点：合成复杂②宿主菌的要求1）具有高浓度、高产量、高产率2）能利用廉价原料而得3）不致病、不产生内毒素4）发热量低、需氧低，适当发酵温度和细胞形态（培养条件温和）5）易代谢调控、易进行重组DNA技术6）产物易提取纯化③影响基因在大肠杆菌中表达的因素：1）表达质粒的拷贝数和稳定性（一定范围内，表达和拷贝数成正比；载体越小，稳定性越好）2）外源基因的表达效率3）表达产物的稳定性4）细胞代谢负荷5）工程菌的培养条件2.6（名词解释2）基因工程的不稳定性：传代过程中出现的质粒不稳定现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定，（稳定性至少维持25代），分裂不稳定指工程菌分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌现象（整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸）；结构不稳定指DNA从质粒上丢失/碱基重排、缺失所致工程菌性能改变（导致其表观生物学功能丧失）。
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生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA.♦酶切反应的温度♦DNA的分子结构♦反应缓冲液组成♦反应时间、反应体积等➢工具酶✦核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。
主要存在于原核微生物中。
•同裂酶：指来源不同,识别序列相同的酶；进行同样的切割,产生相同的末端•同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端DNA甲基化酶：具有宿主专一性,对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解✦DNA连接酶•T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段•大肠杆菌DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA 片段✦聚合酶：以DNA或RNA为模板,将核苷酸连续加至3’-OH末端，合成方向为5’→3'.DNA聚合酶、RNA聚合酶•大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5'→3’DNA聚合酶活性;5’→3’DNA外切酶活性;3'→5'DNA外切酶活性;RNA H酶活性•Klenow酶:不具备5’→3’DNA外切酶活性•T4噬菌体DNA聚合酶:不具备5'→3’DNA外切酶活性。
外切酶活性比Klenow酶强200倍,对单链DNA作用强于双链DNA•T7噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性•Taq DNA聚合酶•反转录酶:催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性•末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP沿5'→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；不需要模板➢载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力.✦质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线状DNA(lDNA）•质粒的三个重要性质:遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性•用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点•常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体✦λ噬菌体载体：插入型载体、置换载体•来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库.➢目的基因的常用制备方法✦化学合成法:前提：基因的DNA的序列已知。
小于100bp的片段:直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。
大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法✦PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
✦基因文库法：鸟枪法:适用于原核细菌目的基因的克隆分离✦cDNA文库法(与mRNA互补的DNA）并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难第一链：mRNA模板,引物（polyT）,逆转录酶,dNTPs第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5'端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸;Klenow酶，dNTPs；S1内切酶）引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT，Dctp;NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs)♦基因文库的完备性:指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln（1–f），P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小♦双酶切产生的粘性末端,最常用，可以确保连接方向的正确性♦影响连接效率的因素:连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1;连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系➢重组DNA导入宿主细胞✦导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法✦导入酵母：电转化法；化学转化法;原生质转化法✦导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法✦重组DNA导入哺乳动物细胞:显微注射法；DEAE葡聚糖转染法;DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法;细胞融合法；病毒感染法➢重组子的筛选与鉴定✦遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法（蓝白斑筛选—-载体含有LacZα基因，X—gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法✦核酸分子杂交法：菌落原位杂交法;DNA印迹法；RNA印迹法✦限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆✦DNA序列测定法✦目的基因表达产物测定法原核细胞表达的特点及选择✦大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产（成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等✦缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解★外源基因表达的调控原件：复制子、启动子（表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点（即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号✦用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子（一般有）、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列）★外源基因在大肠杆菌中的表达方式✦胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态,易被降解，易形成包涵体。
有原核多肽基因融合蛋白表达:表达效率高;产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白✦分泌表达:有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达★外源蛋白表达效率的影响因素✦外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子,外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子✦mRNA的结构：改变一级结构;降低5’端二级结构稳定性;调控3'端非翻译区二级结构✦表达载体的选择：表达方式；强的复制子(拷贝数高）；强的启动子(转录效率高）；高效率的核糖体结合位点;强的终止子(提高mRNA稳定性)；适应范围广;稳定性高；产物易纯化。
✦外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株真核细胞表达的特点及选择➢常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较大肠杆菌巴斯德毕赤酵母载体原核载体穿梭载体调控序列原核原核和真核表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌翻译后修饰基本无有生产方式发酵，操作简单、经济发酵，操作较简单、较经济★酵母表达体系的影响因素✦外源基因的结构外源基因5'端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进行富含A—T序列导致转录提前终止密码子的偏好性高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率✦表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达✦启动子:多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子✦转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高✦诱导条件：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择✦外源蛋白的降解:采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性.➢哺乳动物细胞表达系统✦表达载体:病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等);质粒载体✦表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达➢基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取➢基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱➢选择分离纯化方法的依据✦根据表达形式选择♦分泌型：沉淀和超滤♦周质表达：溶菌酶处理＋渗透压休克♦胞内可溶表达：亲和层析或离子交换层析♦胞内不溶表达（包涵体）：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。
✦根据分离单元之间的衔接选择♦先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。
合理选择色谱分离次序✦根据分离纯化工艺的要求选择♦具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；尽量较少组成工艺步骤;所用时间尽可能短；工艺和技术必须高效★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比,不同的方面✦Mr远大于小分子化学物质,致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。
如质谱✦基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法✦两者杂质性质差别较大.小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留,其检测一般都用专用的试剂盒.✦药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反应的方式★基因工程药物的质量控制1、蛋白质含量的测定✦紫外吸收光谱：在280nm有最大吸收值.快速,无破坏性.不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。