生物技术制药要点

生物技术制药要点概括

1.现代生物技术发展大事记：

年代主要发现和进展

1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构

1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA

1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用

1966 破译遗传密码

1967 分离得到DNA连接酶

1970 分离出第一个限制性内切酶

1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA

1972 合成了完整了tRNA基因

1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术

1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术

1976 DNA测序技术诞生

1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素

1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用

1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生

1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准

1983 基因工程Ti质粒用于植物转化

1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生

1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案

1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉

1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验

2001 人类基因组草图完成

2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市

2008 人类将表皮细胞激活为干细胞

2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。

3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。

4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。

5.生物技术药物与化学药物的区别：

6.组合化学（Combinatorial Chemistry）方法：是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机械手结合一体，并在短时间内将不同构建模块根据组合原理，系统反复连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库(compound library)，然后运用组合原理，以巧妙的手段对库成分进行筛选优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。

7.基因组学（Genomics ）：是对一个生物体的整个基因组的系统性研究。核心目标是将细胞的全部DNA进行测序，绘制基因组排序的物理图谱，对各种基因和非编码区在基因组中的精确定位。

8.蛋白质组学（Proteomics ）：是指由一个细胞或组织的基因组在某一特定环境下的某一时刻所表达的全部相应的蛋白质，目的是提供正常人和病体中总体蛋白质的结构、功能及调控的详细信息。

9.生物技术药物质量控制相关英文缩写：

FDA：Food & Drug Administration(食品药物监督管理局)

SFDA：State Food & Drug Administration（中国国家食品药品监督管理局）

GLP：Good Laboratory Practice（药物非临床研究质量管理规范）

GCP：Good Clinical Practice（药品临床试验质量管理规范）

GMP：Good Manufacture Practice（药品生产质量管理规范）

10.生物技术药物的分析检测：

○电泳分析（electrophoresis analysis）：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。SDS-PAGE用于蛋白质亚基解离、变性，游离成单独的肽链，用SDS掩盖蛋白质表面的电荷，使所有肽链均带上相同密度的负电荷，因此肽链在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的速率只取决于肽链的相对分子质量，用已知相对分子质量的标准蛋白marker作为残币，可以测得待测蛋白质亚基的相对分子质量；琼脂糖凝胶电泳常用于核算分离及相对分子质量测定，核酸片段在琼脂糖中的迁移速率取决于核酸分子的大小及形状，与其相对分子质量的对数值成反比，DNA的构型对迁移率产生很大的影响，迁移率按从大到小依次为：共价闭合环状DNA、线型DNA、开环的双链环状DNA；

○凝胶色谱分析（gel chromatography analysis）；是测定大分子相对分子质量的一种常用方法，可以测定大分子相对分子质量的分布，尤其是多糖，由于不同的大分子具有不同的空间尺寸，因此它们在凝胶层中移动的路径不同；

○酶分析法（enzyme assay method）；

○免疫分析（immunoassay）：是利用抗原/抗体之间的特异性结合作用来选择性识别和测定可作为抗体或抗原的待测物的分析方法，具有高度的特异性和敏感性；标记免疫分析方法是指将试剂抗原/抗体用具有很高检测灵敏度的标记物标记，发生免疫反应后测定反应物或复合物中标记物的量的变化，间接测定待测抗原或抗体的含量/浓度；酶联免疫吸附分析法（ELISA--enzyme-linked immunosorbent assay）是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展的一种免疫分析方法，其原理是将抗原或抗体与某种酶联结成酶标记抗原或抗体，这种酶标记抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

11.抗原（antigen，Ag）是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质，具有免疫原性和抗原特异性的特征。

12.抗体（antibody，Ab）是指机体经抗原刺激后由免疫细胞产生的一组免疫球蛋白，其具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原发生专一性反应，用于防御外界物质对机体的侵袭。

13.基因工程制药的基本过程：获得目的基因（切）－组建重组质粒（接）－构建基因工程菌或细胞（转）－培养工程菌（增）－产物分离纯化（检）－除菌过滤（分离）－半成品和成品鉴定（除菌）—包装。

14.目的基因的获得：反转录法；反转录-PCR反应法；化学合成法；筛选基因的新方法（编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术的应用）；对已发现基因的改造。

15.基因载体的选择：

○质粒载体：pET-32a（+）：E.coli中表达的优良载体，受T7噬菌体强转录的翻译控制，具有Amp r抗性，酶切位点丰富，含T7lac启动子，含有T7.Tag和His-Tag融合标签，便于检测和纯化目标蛋白；pPIC9K：巴斯德毕赤霉菌中表达的优良载体，是真核表达常用载体，

复制起始位点，具有4可在酵母及原核生物中表达，具有Amp r和Kan r抗性标记，含Col E

1

个多克隆位点，含强启动子AOXI，能被甲醇诱导，含α因子信号肽序列，为分泌型表达；○λ噬菌体载体：基因组为线性双链DNA，约50kb，可编码61个基因，宿主E.coli，两端各有12个碱基组成的5'端凸出的互补粘性末端（cos位点），可成环，允许插入多达2kb的外源基因片段；

○腺病毒载体：无包膜的线性双链DNA病毒，由252个壳粒以二十面体排列而成，基因组长度36Kb，分布着4个早期转录元（E1、E2、E3、E4）负责承担调节功能，另有一个晚期转录元负责结构蛋白编码，腺病毒载体特点为：宿主范围广，基因组较稳定，较少发生重排，传代稳定性较好，转导效率高，与人类基因同源，因此能为人类蛋白质进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供较理想的环境。

16.宿主细胞与表达系统中酵母目的基因表达的影响因素：◎外源基因剂量；◎外源基因的表达效率（启动子、分泌信号、终止序列）；◎外源戴白糖基化（N-糖基化、O-糖基化）；◎宿主菌株的影响（宿主菌的生长力要强、宿主菌内源蛋白酶活性应较低、宿主菌的性能应稳定，避免使用恢复突变率高的菌株、应有较强的分泌能力）。

17.基因工程药物的生产工艺：◎中试：是指从实验室研究到产业化必须经过中间放大试验的系列工艺研究和验证，这种中间放大试验简称“中试”，中试研究就是将基因工程从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段，目的是建立一条完全模拟实际生产条件的小型生产流水线，并对一系列参数和条件进行优化；◎基因重组蛋白的发酵生产—高密度发酵：发酵条件的改造、构建产酸能力弱的工程菌、构建蛋白水解酶活力低的工程菌；◎重组蛋白的分离纯化：＃建立分离纯化工艺的各种因素（发酵液特点：产物浓度低组分复杂；不同菌种、不同培养基和不同工艺条件下得到的发酵液成分存在差异；不同类型产品的物化

性质和生物学性质差异；料液中杂质的种类和性质）（产品用途和质量要求：纯度、活性、比活性、杂质含量控制要求；产品剂型、给药途径要求；贮存、运输条件要求）＃分离纯化流程：收集细胞－细胞破碎（物理法、化学法、生物法）－固液分离－（包涵体复性）－粗分离－纯化精制－制剂。

18.离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC）：固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。19.亲和层析（affinity chromatography，AC）:利用固定化配体与目标蛋白之间特异的生物亲和力进行可逆吸附，从而实现与杂蛋白分离的层析方法。

20.变性蛋白的复性技术过程：包涵体的收集（破碎离心）－包涵体的纯化－包涵体溶解（蛋白肽链的伸展）－肽链的重折叠（回复天然构象）。

21.细胞工程（cell engineering）：利用细胞生物学和分子生物学等方法，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞产品、药品或新型物种的综合技术体系。

22.动物细胞融合（cell fusion）技术：将两个或多个真核细胞合并成为一个双核或多核细胞的技术；◎同核体：基因型相同的细胞融合而得到的多核细胞；◎异核体：由不同基因型的细胞融合而得到的多核细胞（杂种细胞），存活下来的细胞可分裂成两个合核体（单核杂种细胞）。（融合方法：仙台病毒诱导法、PEG诱导融合、电诱导融合）。

23.细胞核移植（nuclear transfer）技术：将外源细胞核移入去核的卵母细胞中，构建重组胚胎，经体外培养再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。

24.细胞系（cell line）：由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体。

25.细胞株（cell strain）：从一个经过生物学鉴定的细胞系中，用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。

26.单倍体：体细胞中含有本物种配子染色体数目（即体细胞染色体数目的一半）的个体，通常由未受精的生殖细胞直接发育而来；二倍体：体细胞中含有两个染色体的个体，由受精卵发育而来；多倍体：体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体，由受精卵发育而来，在植物中经常出现，但动物中较少见；异倍体：具有不成套染色体组的细胞或个体。

27.单克隆抗体的大量制备：

◎动物体内诱生法：往小鼠腹腔内注射降植烷（或液体石蜡），破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境（具体方法：接种杂交瘤细胞前1~2周，小鼠腹腔注射降植烷0.5ml，

而后注射1*106个杂交细胞；一般在接种后7~12天生成腹水后，抽取，离心除去细胞，取

上清液冻存；反复操作数次，可获得较多的抗体）；

◎体外培养法：悬浮培养：采用RPMI1640培养液，添加10~20%胎牛血清；悬浮培养的

细胞密度可达2*107/ml，McAb为0.4mg/ml；固定化培养-微载体悬浮培养：采用

DEAE-Sephadex A 50等微粒材料作为细胞固定化载体，增大比表面积，细胞密度可达

105/ml，McAb的浓度显著提高。

抗体、28.基因工程抗体的种类：人-鼠嵌合抗体，CDR移植抗体，小分子抗体（Fab抗体、F

v

单链抗体、单域抗体、分子识别单位），多功能抗体。

29.人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimaric antibody）：

◎设计思路：lg分子的C区决定了其异种抗原性；lg分子的V区几乎不产生免疫原性；将

鼠源性McAb的C区用人lg分子的C区替换，则McAb对人的免疫原性大大减小；

◎人-鼠嵌合抗体的构建：＃可变区（V区）基因克隆——逆转录法：提取杂交瘤细胞的

mRNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，采用特异性引物，PCR扩增V

L 和V

H

基因；

＃表达载体的构建：将V

L 和V

H

基因分别连接真核表达系统所需的转录元件，将V

L

基因

克隆到人lgC

L 的基因表达载体上，将V

H

基因克隆到人lgγ

1

的C基因真核表达载体上，将

人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用霉酚酸进行筛选，筛选出形成集落的细胞。

30.CDR移植抗体（CDR grafting antibody）：

◎设计思路：lg分子中参与构成抗原结合部位的区域是V

H 和V

L

区中的6个CDR区，而

非整个可变区，框架区主要起支持CDR的作用，氨基酸组成和立体结构较为保守，抗体中鼠源部分比例较小，基本消除免疫原性；

◎CDR移植抗体的构建原理：在选择骨架区（FR区）时，从已知的人源抗体V区数据库中选择与亲本抗体同源性最高的序列，最大可能地维持原抗体的天然构型，提高CDR移植抗体的亲和性；将FR区内可能影响抗原结合部位的氨基酸残基替换为亲本鼠单抗的氨基酸残基；抗体V区的N-末端，特别是轻链N-末端的数个氨基酸残基应选择性地一同移植；

◎CDR移植抗体的构建方法：＃全合成法：将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端；合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，即可用于构建和表达改形抗体；＃定点突变法：将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改形抗体。

31.Fab抗体：包含完整的轻链和一半长度的重链；通过木瓜蛋白酶水解得到，链间含有二硫键；占完整抗体分子大小的1/3，具有一个抗原结合位点；重组Fab抗体需将C区改用人源性片段，V区为鼠源性片段，降低免疫原性。

32.F

V 抗体：◎抗体可变区片段（V

H

和V

L

）；◎抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能

片段；◎V

H 和V

L

通过非共价键结合，容易解离；◎抗体片段小，约为全分子的1/6，透

过性好。

33.单链抗体（single chain F

V ，scF

V

）：◎用一段弹性连接肽（linker）将抗体VH 和VL 通

过共价键连接；◎Linker的长度一般为15个氨基酸残基，常用的氨基酸序列为(Gly—Gly—

Gly—Gly—Ser)

3；◎scF

V

的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法，合成linker

的基因，将V

H 和V

L

基因连接；◎分子小，容易进入组织，易于改造；体内半衰期短，免

疫原性较低；◎稳定性依然不高，且亲和力较低。

34.单域抗体（single-domain antibody）：只由一个结构域构成的抗体片段，即V

H 和V

L

，常

用V

H ；约为完整抗体分子长度的1/12；亲和力远小于F

V

，但保留了抗原结合活性。

35.分子识别单位（molecular recognition unit，MRU）：也称最小识别单位，约为完整分子的1/80～1/70；抗原特异性结合能力主要由CDR3决定，由此构建的CDR3小肽仍具有抗原结合能力，但亲和力很低。

36.植物细胞的全能性（totipotency）：植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞都可以重新再分化形成原有的个体的能力，植物细胞的全能性是植物体外培养的重要前提。

37.脱分化（dedifferentiation）：已分化的细胞、组织、器官在人工培养的条件下又变回未分化的细胞和组织的过程。

38.再分化（redierentiation）：在离体条件下，无序生长的脱分化细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。

39.外植体（explant）：用来进行体外无菌培养的离体材料，可以是器官、组织及其切段，或细胞、原生质体等。

40.愈伤组织（callus）：由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体。本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织。

41.植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较：

42.植物细胞培养的生物反应器的优缺点：

◎机械搅拌反应器：优点是具有很高的溶氧洗漱，缺点是大部分植物细胞对剪切力较敏感，用于植物组培的搅拌式反应器一般需对搅拌桨进行改造；

◎气升式反应器：剪切力较小，对植物细胞的伤害较小；培养液不断循环，混合效果较好；反应器中有时候会存在“死角”和“沟流”；

◎鼓泡式反应器：结构简单，剪切力小，氧传递和传热效率高，缺点是反应器中有时候会存在“死角”和“沟流”；

◎固定化细胞反应器：可保护细胞免受剪切损伤，细胞可长时间重复使用，并可实现连续化操作，可实现高密度操作，细胞间接触良好，易于分化，有利于次生代谢产物生成，减少细胞的遗传不稳定性。

43.提高次生代谢产物的策略：

◎培养基成分优化：＃碳源：通常情况下，碳源含量提高，对次生代谢产物合成有利；＃氮源：氮源的情况比较复杂，有时候取决于NH4+ 和NO3- 含量的比例，有时候氮源含量较低反而对次生代谢产物的合成有利；＃磷元素：一般情况下高磷含量能促进细胞生长，却不利于次生代谢产物的积累；＃生长激素：其种类和浓度对次生代谢物的积累具有关键作用；＃前体物质：添加合成前体物质是提高次生代谢产物产量的有效途径，但过多的前体物质会

对细胞生长带来一定的负面影响；

◎培养条件的优化：温度、光照条件、pH值、溶氧浓度；

◎添加诱导子：诱导子是可以引起代谢途径及强度发生变化的物质，它通过影响相应酶基因的表达，调节代谢过程中某些酶的活性，进而影响次生代谢产物合成途径的代谢通量；＃基因水平、转录水平以及代谢水平上的调节；＃生物诱导子：真菌菌丝体、酵母提取液、多糖、糖蛋白和植物细胞壁碎片等；＃非生物诱导子：金属离子、有机酸以及紫外线、激光等射线。

44.生物转化（biotransformation）：利用生物离体培养的细胞、器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应。

45.紫杉醇（paclitaxel，T axol）：（红豆杉细胞培养生产紫杉醇）◎红豆杉愈伤组织诱导：以幼茎为外植体，在20～26 O C及黑暗中诱导，并添加适量的NAA、2,4-D 等生长激素。愈

伤组织一般呈浅黄色，易碎；愈伤组织细胞易发生褐变现象（多酚氧化），需添加一定量的抗褐变剂，如活性炭、水解乳蛋白和植酸；◎红豆杉高产细胞系建立：广泛采集不同品种、产地、树龄的各种红豆杉属植株的各种组织，分别诱导愈伤组织，建立新的无性细胞系；紫外线诱变及低密度培养，快速筛选高产细胞株；多次继代培养考察细胞系遗传及紫杉醇合成能力的稳定性，筛选出高产细胞系，并进行种质保存；◎培养基的优化：采用两步培养法，分别采用不同的培养基；在红豆杉细胞生长阶段，可直接使用常用的MS培养基、B5培养基及M62培养基等，培养过程中不断流加蔗糖；在紫杉醇合成阶段，高碳源含量及低氮源、磷源含量有利于紫杉醇的合成和积累；应采用较低水平的氮源和磷含量；提高生长激素6-苄基嘌呤（6-BA）的浓度；◎提高紫杉醇产量的方法：培养条件优化：＃pH 4.5，22～25 oC，较低的溶氧，暗室中培养；＃添加适当的诱导子：茉莉酮酸、花生四烯酸、水杨酸、铈(IV)盐、真菌诱导子等；＃添加合成的前体物质：苯丙氨酸、苯甲酰甘氨酸，羟甲基戊酸、蒎烯、巴卡亭III等；＃添加细胞分泌促进剂，将紫杉醇分泌到胞外：稀土元素、DMSO、甘露醇等。

46.强心苷（cardiac glycosides）：（洋地黄细胞培养转化强心苷）◎洋地黄细胞的培养：

含KH2PO4 340 mg·L1-的MS培养基，添加1 g·L1-水解酪蛋白，6% 蔗糖，微量激动素、IAA，调pH 5.5，加入8% 琼脂；选取洋地黄叶片，切割成小片，用水洗净后依次用次氯酸钠溶液(15 min) 和70%乙醇(10 min) 消毒，洗净擦干；接种到固体培养基，25O C

黑暗处培养，1～2星期后在切口处形成愈伤组织；转移至新的同样的培养基中继代培养，每隔一定时间继代培养一次，建立细胞系；（地高辛的生物转化）◎地高辛的生物转化：毛花洋地黄悬浮培养细胞系W.1.4，采用1 L和20 L反应器转化洋地黄毒苷，转化得到的地

高辛浓度分别为0.52 mmol·L1-和0.53 mmol·L1-；采用半连续培养和细胞循环利用的培养方式，在300 L反应器中装液200 L，培养28天，转移至装有含8%葡萄糖的PM1培养基的另一个300 L气升式反应器中；将洋地黄毒苷溶解在DMSO（30 g·L1-）中投料，保持其浓度在0.65～0.8 mmol·L1-之间，经40～60 h转化后产物地高辛的最高含量达到0.60 mmol·L1-；（西地兰的生物转化）◎西地兰的生物转化：细胞系为毛花洋地黄细胞株W.1.4，在含有180 ml PM2培养基的1 L摇瓶中培养3天；加入470～530 mg·L1-底物洋地黄毒

苷，转化7.5天，分离出细胞，继续重复使用9次后，西地兰的总量达到2.0 g；采用20 L 气升式反应器进行过程放大，培养基PM2装液18 L；培养3天后加入洋地黄毒苷10.8 g（600

mg·L1-），转化7天后收获细胞并循环使用，经6次循环操作，西地兰产量可达43.8 g；

47.青蒿素（artemisinin，arteannuin）：（青蒿毛状根培养生产青蒿素）◎青蒿毛状根培养生产青蒿素：发根农杆菌A. rhizogenes ATCC 15834 转化的青蒿株系025发根中，筛选出53个生长较快的无菌发根系；经过3代继代培养，建立起7个无菌发根系，保存于改良的含3% 蔗糖的MS液体培养基中，每2周传代一次；在盛有50 ml改良MS培养基的250 ml 摇瓶中，接种0.1 g鲜重、2～4 cm长的发根根尖进行摇瓶培养，转速100 rpm，光照周期

16 h，强度2000 lux，培养3周，青蒿素的产率可达到每月33.25 mg·L1-；取出发根，吸干培养液，烘干，粉碎，用石油醚提取青蒿素；（黄花蒿细胞培养生产青蒿素）◎黄花蒿细胞培养生产青蒿素：采集黄花蒿叶为外植体，洗净，浸入70%乙醇消毒1 min，再换0.1% HgCl2 溶液消毒5 min，取出，用无菌水洗净；叶片切成1 cm2的小片，接种至B5 培养

基(2%蔗糖、0.7%琼脂及微量生长激素)，25O C光照培养3周，诱导愈伤组织；取新鲜愈伤组织5 g 转接入50 ml相同培养基，每天光照8 h，在115 rpm、25 O C下培养1周，每

3天更换一次培养基。3周之后，细胞团自身发生聚集，形成自固定化细胞系；之后每10天倾出一次培养基，有机溶剂萃取青蒿素并纯化，青蒿素最大含量为0.038%。

48.酶工程（enzyme engineering）：应用酶的特异性催化功能并通过工程化将原料转化为有用物质的技术。

49.生物催化（biocatalysis）：利用酶或生物有机体（细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程。

50.酶和细胞固定化方法：

51.固定化酶（immobilized enzyme）：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

52.固定化细胞（immobilized cell）：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术，被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶一起称为固定化生物催化剂。

53.发酵基本过程：菌种（菌种生产能力、生长繁殖和代谢特性直接决定发酵水平；发酵工业中采用的是经人工选育的优良菌种；生产菌种应不断定期纯化、复壮，防止退化）－－种子制备（使菌种繁殖，以获得足够数量的菌体，以便接种到发酵罐中；摇瓶－小罐（种子罐）

－中罐－大罐；火环接种，减少染菌几率）－－发酵（目的是使微生物产生大量的目的产物；灭菌－接种－搅拌、通气发酵－放罐；维持一定的罐温和罐压；定时取样分析和无菌试验；加入消泡剂控制泡沫；补料系统，流加酸、碱调节pH）－－发酵液中产物提取精制（发酵液预处理，产物捕获、富集；分离、精制）。

54.发酵过程工艺控制：◎培养基（碳源-构成细胞碳骨架、能量来源；氮源-结构物质，多种次级代谢产物成分；无机盐-构成原生质体成分、作为酶的组成部分或维持酶的活性。调节渗透压及PH、参与产物合成；水-构成细胞主要物质、营养运输介质、酶催化反应溶剂）；◎温度—发酵过程热量变化（生物热、机械热、蒸发热、辐射热）；◎溶氧的影响与控制（临界氧）；◎pH值的影响（主要影响酶的活性和膜的通透性）。