腺相关病毒细胞感染手册
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒感染
临床表现-呼吸系统
腺病毒感染引起的呼吸道感染主要发生在儿童中，大多数无症状或者 症状轻，常见疾病为：鼻炎、咽炎、扁桃体炎、支气管炎等。在6月-2岁 的婴幼儿可以发生致死性肺炎和毛细支气管炎，有人报道可以导致百日 咳样综合征。
实验室检测
腺病毒感染的儿童中几乎一半以上有白细胞增高，可超过15×10^9/L, 血沉高于正常，CRP 高于正常，而在其他病毒感染时，白细胞稍高或正 常 ，CRP 及血沉大部分正常，我国腺病毒3、7型肺炎时白细胞计数大多 不高，尿中可以出现微量蛋白质。
诊断
一 、临床诊断：腺病毒感染常常只能依靠临床诊断、体征和流行病学， 病毒诊断其实很重要，典型临床症状加流行病学史可初步诊断，但对于 散发的需确诊必须找到病原学诊断。 二 、病原学诊断：病毒分离以及抗体检测，检查标本可以来自咽拭子、 刮片、大小便、脑脊液及组织活检，大便因其排毒时间长，故其诊断意 义不如急性期采取标本处理。 三 、血清学检测：测得病人血清特异性抗体晚期较早期上升4倍或4倍以 上有诊断价值。
临床表现-泌尿系
出 血性膀胱炎：在儿童出血性膀胱炎的病人中，20-50 % 左右的患儿尿液 可分离出此病毒，以11 、21型多见，病人血清抗体上升，从尿液脱落细 胞可以找到腺病毒，临床表现以急性膀胱炎症状为主，尿痛、尿频、遗 尿、可伴随发热，在肾移植病人中可分离出病毒，故认为病毒可能非上 行感染所致，可能来自血液病毒。
病毒侵入细胞后引起至少3种作用。 1.溶解性感染：病毒侵入人细胞，通过溶解细胞作用，使细胞死亡。 2.慢性潜伏性感染：常在淋巴细胞内出现，潜伏感染时病毒量极少， 临床症状不明显，机制尚不明确。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。
2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。
6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。
7实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法。
2腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
产品说明书【详见维真⽣物官⽹→（腺相关病毒包装+腺相关病毒制备+腺相关病毒案例分享+腺相关病毒技术⼿册），或联系官⽹在线客服索要相关内容的链接。
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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
sunbio AAV产品手册 最终版
上海生博AAV产品手册（2017版）一、AAV背景知识1.1AAV概况腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，是一类无包膜的细小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus)，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下，AAV病毒本身呈二十面体结构。
AAV 基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，只含两个基因，Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。
AAV为目前发现的基因组最简单的复制缺陷型病毒，也因此，AAV被作为病毒载体广泛应用。
FIG1 AAV的3D构象图FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成FIG1和FIG2文献出处：Mingozzi, F. and K.A. High.Blood, 2013. 122(1): p. 23-36.FIG3 AAV TEM图Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.1.2AAV的ITR区AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。
ITR区富含GC(>80%)，可折叠为一个自我互补的T型发卡结构，其中的Rep蛋白结合位点(Rep binding elements，RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site，TRS)是AAV 基因组的复制起始的关键。
另外ITR区还含有包装信号，是AAV整合、复制和包装所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子活性。
FIG4 AAV基因组结构图Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.1.3AAV的ORFAAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Rep基因和Cap基因。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
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腺相关病毒（AAV）感染目的细胞
腺相关病毒（AAV）感染目的细胞
一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介
腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构
二、腺相关病毒的优点
1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；
2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；
3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；
4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；
5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；
三、重组腺相关病毒载体不同血清型
研究发现AA V具有多种血清型，各种不同血清型的AA V载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。
目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。
四、AAV感染目的细胞
不同的AAV血清型对不同的细胞有相对的亲和力，因此，对于AAV来说，不同类型的细胞的侵染实验，首先需要确定合适的AAV 血清型，在此基础上进行最适MOI的摸索。
（一）关于最适血清型摸索
下图以AAV-2为标准侵染分数（100分），给出了不同的AAV 血清型对于不同细胞的侵染能力，比如Huh-7，DJ型为500，意味着DJ对与Huh-7的侵染能力是AAV-2的5倍，部分细胞的侵染血清型确定可根据下表来确定，但我们仍建议在进行正式实验之前，进行最适血清型的预实验摸索。
大部分细胞来说，AAV-DJ是AAV血清型里侵染细胞能力最强的一组血清型。
（二）关于最适MOI摸索
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。
通常MOI越高，AAV病毒感染后宿主细胞内保留的腺病毒基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。
AAV对离体细胞的感染能力比较有限，所需病毒MOI大于104，
通过选择合适的血清型并使用合适的病毒感染MOI仍然可以达到一定的感染效果。
AAV病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。
每种细胞对应每种类型的病毒都应该进行最适MOI摸索实验，设置MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。
AAV细胞感染的MOI一般以104：105：106进行梯度摸索。
（三）感染步骤：
1.细胞培养：
将状态良好的目的细胞接种到细胞培养皿中，尽量使用小孔培养皿（24孔板或者48孔板），接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
2.MOI对应病毒体积的换算
转染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。
例子：转染细胞数为105个，MOI为105，则需要病毒的个数为1010个，病毒如果滴度为1012v.g/ml，则需要加入的病毒体积为1010/（1012v.g/ml）=10-2ml=10ul。
3.AAV感染目的细胞
感染实验分为两组，分别添加相应目的的AAV和等滴度同体积的对照AAV，1/2体积培养液感染（详见下表格）。
加入的病毒量范围推荐MOI为=104；105；106内。
1/2体积感染2小时后，不换液，追
加1/2新鲜培液，继续37度感染过夜。
感染12-24小时候换新鲜培液。
病毒小培养体积感染表
培养皿类型表面积
/cm2
对应细胞培养液体积病毒感染对应细胞培
养液体积
96-well0.3cm2100ul50ul
24-well2cm2500ul250ul
12-well4cm21ml500ul
6-well10cm22ml1ml
60mm20cm24ml2ml
100mm60cm210ml5ml
腺病毒感染4小时后补足至培养体积，感染24小时后换液，腺病毒感染2小时后
直接换液
5、观察感染情况
感染72-96小时后，可以开始观察到GFP/RFP表达（只对于有GFP/RFP独立表达框的AAV），过表达和干扰的感染时间以96小时以上实验为最佳，也有细胞需要延长至1-2周左右观察。
（四）关于提高AAV感染效率的方法
1.Polybrene
Polybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高腺相关病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高部分细胞感染效率2～10倍。
对于polybrene适用的细胞，1/2体积感染的培液中，polybrene
浓度为固定值（5～8ug/ml,我们建议5ug/ml即可）；如2小时后停
止感染置换新鲜培液，则无需再加入polybrene（针对上述增殖能力
弱的细胞）；如2小时1/2体积感染后继续追加培液感染过夜，则补
充的新鲜培液中要含有等终浓度的polybrene。
2.腺病毒助染
AAV，腺相关病毒，是一种依赖于腺病毒完成周期的病毒。
在AAV 细胞侵染实验中加入腺病毒，往往能极大提高AAV对细胞的感染效率。
具体操作时可将腺病毒以MOI=10-100加入需侵染的细胞中，再进行AAV侵染。
但是由于腺病毒助染时，腺病毒侵染细胞对实验会多了一个可变因素，我们一般不建议用该方法进行AAV助感染。