生物化学实验指导手册

实验一、考马斯亮蓝G-250

【实验目的】

学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。

【实验材料、仪器及试剂】

1．材料：新鲜的植物材料

2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗

（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml

（2）考马斯亮蓝G-250溶液：

【实验步骤】

1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。

2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。

将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。【结果计算】

C × V T

样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝

V S×W F×1000

式中：C为查标准曲线值（ug）；V T为提取液总体积（ml）；

V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）。

实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定

【实验目的】

学习掌握鲜材料中游离氨基酸含量测定的原理和方法。

【实验原理】

当氨基酸与水合茚三酮共热时，能定量地生成酮茚胺。该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。其最大吸收值在570nm ，并在一定范围内与氨基酸含量成正比。氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。

【实验材料，仪器及试剂】

1．材料：新鲜的植物材料

2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3．试剂：（1）水合茚三酮试剂（2）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）（3）标准亮氨酸标准液∶含氮为5ug/ml （4）0.3%抗坏血酸溶液：

【实验步骤】

1．样品提取∶取新鲜植物样品0.5-1g，加5ml 10%醋酸研磨，离心取上清液0.5ml，用pH5.4醋酸盐缓冲液，定容至25ml。

2．标准曲线的绘制：取6支20ml刻度试管，按下表进行操作。

加完试剂后混匀，在沸水中煮 5分钟，然后在冷水中冷却、摇匀，稀释到20毫升。用1cm 光径比色杯在570nm下测定吸光度，绘制标准曲线，根据样品吸光值在标准曲线查得氨基态氮含量。【结果计算】

C×V T

100克样品中氨基态氮含量＝×100

V S×W F

式中∶C为从标准曲线上查得的氨基态氮含量(ug)；V T为提取液总体积（ml）；

V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）

实验三酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响

（一）酶的特异性

【实验原理】

酶具有高度的特异性，一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物，如淀粉酶，只能催化淀粉水解，而不能使蔗糖水解。本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用，来说明酶的特异性。

【实验试剂】

1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液

3．0.5%蔗糖液

4．Benedict试剂

A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；

B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3（无水）100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；

C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。（可长期保存）。

【实验步骤】

1．取试管两支，一支加入0.5%淀粉液2mL，另一支加入0.5%蔗糖液2mL；

2．于两支试管中各加入制备好的唾液1mL；

3．将两支试管同时放入37℃恒温水浴箱中保温；

4．15分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；

5．将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；

6．取出两试管，观察记录颜色的变化，并注意有无红色沉淀产生，为什么？

（二）温度对酶活性的影响

【实验原理】

酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行，使酶促反应速度最大时的温度称为此酶的最适温度，低于此温度，酶促反应速度缓慢，高于最适温度，酶蛋白变性失活。本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例，说明温度对酶活性的影响。

【实验试剂】

1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液

3．KI-I溶液

【实验步骤】

1．取三支试管并编号，同时各加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；

2．将管1、管2、管3同时分别放入冰浴，37℃水浴，沸水浴中；

3．15分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化，并解释此现象。

（三）pH对酶活性的影响

【实验原理】

在一定条件下，酶活性最高时的pH值称为最适pH，偏离此pH，酶活性就会有所下降，不同酶的最适pH不同。例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。

本实验以入唾液淀粉酶（最适pH6.8）在不同pH条件下水解淀粉为例，说明pH对酶活性的影响。【实验试剂】

1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。2．pH1.5溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；

2．pH6.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸溶液18.2mL；

3．pH9.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸溶液2.2mL，然后用0.1N NaOH 调至pH9.8。

【实验步骤】

1．取试管3支并编号，如下表加入各试剂；

2．3支试管同时放入37℃恒温水浴箱内保温；

3．15分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加1滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。