CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
cck8细胞增殖实验原理
cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。
本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。
一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。
CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。
实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。
2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。
3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。
4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。
5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。
6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。
二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。
以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。
将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。
2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。
通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。
3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。
通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，该方法通过评估细胞内脱氢酶的活性来间接反映细胞的代谢活性。
其操作步骤如下：1.常规细胞培养选择要测试的细胞系，并在合适的培养基中进行培养。
通常使用细胞培养瓶或培养皿，并在37摄氏度的培养箱中保持恒定的温度。
确保培养基中含有足够的养分和补充物，以支持细胞的正常生长和代谢。
2.细胞计数和均匀分布细胞生长到适当的密度后，使用显微镜和细胞计数板计数细胞数目。
根据需求，将细胞以适当比例分装到不同的瓶中，再将细胞以适当比例分装到96孔板中，以保证每个孔中的细胞数量和均匀分布。
3.平台适应性试验在进行正式的实验前，可以进行平台适应性试验。
为此，将不同细胞浓度的细胞悬液加入到96孔板中，并使用CCK-8试剂进行处理。
根据CCK-8处理后的细胞的吸光度读数，选择适当的浓度范围和时间点进行后续实验。
4.细胞处理在进行CCK-8实验之前，确保细胞在适当的生长条件下。
将上一步骤中准备好的细胞悬液加入到96孔板中，使每个孔中的细胞数目均匀分布。
可以提前设计不同实验组的处理方式，如对照组、实验组和阴性对照组等。
K-8处理按照CCK-8试剂说明书的建议将CCK-8试剂加入到96孔板中的每个孔中。
通常建议每个孔中加入10%的CCK-8试剂，并与细胞悬液充分混合。
注意避免气泡的产生。
6.孵育将96孔板放置在37摄氏度的培养箱中，孵育一段时间。
孵育时间可以根据实验要求设定，通常为1-4小时。
7.吸光度测量使用酶标仪或多功能板读取器测量每个孔的吸光度值。
通常使用450纳米的波长进行测量。
根据吸光度值的变化，可以评估细胞的代谢活性，并进行细胞增殖或毒性分析。
通过以上步骤，可以使用CCK-8试剂评估细胞的增殖和毒性。
这种方法快速、简单且灵敏，被广泛应用于细胞实验中。
需要提醒的是，在进行实验前要仔细阅读CCK-8试剂的使用说明，并根据实际情况进行操作。
cck8检测细胞增殖原理
cck8检测细胞增殖原理
CCK-8（CellCountingKit-8）是一种广泛应用于细胞增殖及细胞毒性实验中的水溶性化合物。
CCK-8试剂盒可以用于评估各种生物、药物和化学物质对细胞增殖的影响。
CCK-8的实现原理是通过测定细胞内还原性代谢活性酶（如脱氢酶）生成的水溶性形式的四氮唑盐的量，从而评估细胞增殖情况。
使用CCK-8检测细胞增殖的方法十分简单。
首先，将待测物（如药物、化学物质等）加入到细胞培养液中，让细胞在特定时间内与其接触。
然后，向培养液中加入适量的CCK-8试剂，并在紫外线或荧光光谱仪中测量吸光度。
CCK-8的加入会使细胞内代谢活性酶发生还原反应，从而产生水溶性四氮唑盐，其吸光度与细胞数量成正比。
因此，吸光度越高，细胞数量也就越多。
CCK-8检测细胞增殖的优点在于其高度灵敏和高通量的特点，能够快速、准确地测定细胞数量，同时减少检测误差和节省实验时间。
因此，CCK-8已经成为了现代细胞生物学和药物研究中不可或缺的实验工具之一。
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高
很高
很高
高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长 细胞毒性
560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
高，细胞形态 很低，细胞形 很低，细胞形 很低，细胞形
完全消失
态不变
态不变
态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般Байду номын сангаас
很好
批量样品检测
可以
非常适合 非常适合 非常适合
便捷程度
一般
便捷
便捷
4
CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
一、CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8（ 简 称 CCK-8） 试 剂 可 用 于 简 便 而准 确的 细胞 增 殖 和 毒 性 分 析 。 其 基 本 原 理 为 ：该 试 剂 中 含 有 WST-8【 化 学 名 ：2-(2-甲 氧 基 -4-硝 基 苯 基 )-3-(4-硝 基 苯 基 )-5-(2,4-二 磺 酸 苯 )-2H-四 唑 单 钠 盐 】， 它 在 电 子 载 体 1-甲 氧 基 -5-甲 基 吩 嗪 鎓硫 酸 二甲 酯 （1-Methoxy PMS） 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物 （ Formazan dye）。生 成 的 甲 瓒 物 的 数 量 与 活 细 胞 的 数 量 成 正 比 。因 此 可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
• 金 属 对 CCK-8 显 色 有 影 响 ：当 终 浓 度 为 1 mM 的 氯 化 亚 铅 、 氯 化 铁 、硫 酸 铜 会 抑 制 5%、15%、90%的 显 色 反 应 ，使 灵 敏 度 降 级 。 如果终浓度是 10 mM 的话，将 会 100%抑制。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK8佥测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8 （简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲氧基 4 硝基苯基）-3-（4- 硝基苯基）-5-（2,4- 二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：・使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；* CCK-8法能快速检测；* CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；* CCK-8法的重复性优于MTT法；・CCK-8法对细胞毒性小；・CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
* CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:现配现用即开即用即开即用使用方法配成溶液后使用二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、 制备细胞悬液：细胞计数2、 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。
3、 37C 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
4、 加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议 在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
cck8法原理和步骤 -回复
cck8法原理和步骤-回复标题：CCK8法原理与步骤详解一、引言细胞增殖是生物体生长、发育、修复等生命活动的基础。
因此，检测细胞增殖活性对于了解细胞的生理状态和病理过程具有重要意义。
其中，CCK8法（Cell Counting Kit-8）作为一种便捷、高效的细胞增殖检测方法，在科研领域得到了广泛的应用。
二、CCK8法的原理CCK8法主要基于WST-8（水溶性四唑盐）这一化合物的工作原理。
WST-8在电子载体1-Methoxy PMS（1-甲氧基苯并三氮唑）的存在下，可以被活细胞内的脱氢酶还原为橙黄色的水溶性形式甲臜。
该反应过程中产生的甲臜量与活细胞的数量成正比，可以通过光度计在450nm处测量吸光值来定量细胞的增殖活性。
这种方法具有操作简单、灵敏度高、干扰小等特点。
三、CCK8法的步骤以下是进行CCK8法实验的基本步骤：1. 细胞培养：首先，根据实验需要选择合适的细胞系，并按照常规的细胞培养方法进行细胞培养。
2. 细胞接种：将细胞调整到适当的浓度后，接种到96孔板中，每个孔通常接种5000-10000个细胞。
接种后的细胞需要在适宜的条件下进行培养。
3. 添加CCK8试剂：在细胞接种后的指定时间点，向每孔加入10体积的CCK8溶液。
然后，将96孔板轻轻摇晃，使CCK8溶液与细胞充分混合。
4. 孵育：将添加了CCK8溶液的96孔板放入孵箱中，继续进行细胞培养。
通常情况下，孵育时间为1-4小时，但具体时间应根据实验条件和细胞类型进行调整。
5. 测定吸光值：孵育结束后，使用光度计在450nm处测定每孔的吸光值。
需要注意的是，为了避免细胞代谢产物对测定结果的影响，应在孵育结束后的1小时内完成吸光值的测定。
6. 数据处理：将测得的吸光值转化为细胞数量或细胞活力，通过绘制细胞生长曲线等方式分析细胞的增殖活性。
四、结论CCK8法是一种简便、快速、准确的细胞增殖检测方法，其基本原理是利用活细胞内脱氢酶的还原作用，将WST-8还原为甲臜，通过测定生成的甲臜量来反映细胞的增殖活性。
CCK8相关检测介绍
CCK-8相关检测介绍K-8检测原理Cell Counting Kit -8，简称CCK-8，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。
其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）化合物被活细胞线粒体内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm 处有最大吸收峰。
甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
2.适用范围可用于细胞活力检测、细胞数量测定细胞增殖测定、细胞抑制、细胞粘附、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等3.实验方法（1）细胞种板数及CCK-8孵育时间摸索根据实验所用细胞查阅文献查看该细胞的推荐种板密度或者自己梯度稀释细胞（如：1000、2000、4000、8000个/孔）种板，24h后加入CCK-8 10ul/孔，37℃孵育1~4h，可分别在0.5h、1h、1.5h、2h 分别读取OD450数值，选取OD值在1.0左右的时间段作为该细胞孵育时间。
（2）正式实验根据前期摸索结果将对数生长期的细胞（一般复苏后传代2次以上）以适宜的密度种板，使用基础培养基过夜饥饿培养后加入梯度稀释好的不同浓度药物，设置复孔3~6孔，根据实验目的选择药物孵育时间，药物孵育结束后加入10ul/孔CCK-8，37℃孵育适宜时间后使用酶标仪测定OD450，可测定OD650进行对照。
（3）分析实验结果4.注意事项种板：（1）离心后重悬细胞计数，多次吹打使其成为单一分散的细胞。
（2）制备细胞悬液于离心管中充分吹打后加入加样槽，铺板时先用枪均匀吹打悬液、上下左右各晃动相同次数后再铺板。
复孔作为一次铺板，先铺边缘一圈，每铺2排重新上下左右晃动细胞悬液并用排枪多次吹打。
铺完半块板后重新吹打细胞悬液重复上述操作。
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！今天小编要为大家介绍的是：CCK-8实验的操作步骤和注意事项。
CCK-8，英文全称是Cell Counting Kit-8。
CCK-8试剂盒可用于简便而准确的细胞增殖和细胞毒性分析。
实验原理CCK-8试剂盒中，最主要化学药品是WST-8【化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，能够被细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜染料(Formazan)。
也就是说，活细胞数量越多，生成的甲臜量就越多，相应地颜色也就越深。
因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析：细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色则越浅。
（对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
）使用酶标仪在450nm波长处测OD值，可间接性反应活细胞的数量。
是一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
（CCK-8实验原理）因此，CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
操作步骤（一）实验材料及试剂：酒精灯、移液枪、酶标仪（带有450nm滤光片）、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。
（二）绘制标准曲线1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔) ：按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度（比如，稀释10倍，100倍......），每组4-6个复孔。
3.绘制标准曲线：接种后培养一定时间待细胞贴壁后，然后每100μL培养基加10μL（10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。
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CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖
和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
CCK8的优点：
•使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
•CCK-8法能快速检测；
•CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
•CCK-8法的重复性优于MTT 法；
•CCK-8法对细胞毒性小；
•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：
•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
•CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：
检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差（需加有机好好好
溶性溶剂溶解）
产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液
使用方法配成溶液后
使用
现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高
检测时间较长较短较短最短
检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm
细胞毒性高，细胞形态
完全消失很低，细胞形
态不变
很低，细胞形
态不变
很低，细胞形
态不变
试剂稳定性一般较差一般很好
批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷
二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果
不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或
者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。
如
果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。
特别是血液细胞形
成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果
不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性
质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。
如
果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。
特别是血液细胞形
成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
注：
•若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24小时内测定，吸光度不会发生变化。
•如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新
的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可
以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项
•当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。
检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐
接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。
•酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
•CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。
在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
•CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
•当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。
一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
•在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。
在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
•金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。
如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
•悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。