死活细胞的鉴定和显微镜直接计数

死活细胞的鉴定和显微镜直接计数

学院：生命科学专业：生物科学年级：2010级姓名：王亚军

指导老师：张琪白璐陈勇

摘要：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。其细胞的大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片可在显微镜下观察到啤酒酵母的形态和出芽生殖方式。用美蓝对啤酒酵母的活细胞进行染色，可对啤酒酵母的死细胞和活细胞进行鉴别。

测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载片上，在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

关键词：啤酒酵母菌美蓝染料血细胞计数板

引言：酵母菌的繁殖方式包括无性繁殖和有性繁殖。无性繁殖方式包括芽殖和裂殖。芽殖是酵母菌最普遍的繁殖方式。其过程是：成熟的母细胞在其形成芽体的部位长出芽细胞，芽细胞脱离母体，成为新的个体细胞。如果不脱离母细胞，又长出新芽，子细胞就和母细胞连接在一起，形成藕节状或竹节状的细胞串，称为假菌丝或真菌丝。少数酵母以裂殖方式进行繁殖，当母细胞长到一定大小时，细胞核开始分裂，之后，在细胞中间产生一隔膜，将细胞一分为二。还有些酵母菌可形成一些无性孢子如节孢子、掷孢子、厚垣孢子等。有性繁殖则是通过形成子囊和子囊孢子。

常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母菌、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。其中用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。

实验内容：

实验原理：

美兰是一种无毒性染液，有两种形态还原型：无色氧化型：蓝色。活细胞因新陈代谢而有强还原力，使美兰从氧化型变为还原型；死细胞无此能力，而被美兰染成蓝色。以此可以区分死活细胞。

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽构成3个平台.中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是25×16：计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是16×25：一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。技术时，通常数五个中方个的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中德总菌数，再换算成一毫升菌液中的总菌数。

实验材料

1.菌种：啤酒酵母

2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝

3.器材：载玻片，显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

三、实验步骤

（一）酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定

1、在载玻片上各滴加一滴染色液和酵母菌培养液，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）

2、将制好的水浸片放置2分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

3、染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。

4、染色一小时后，再观察一下死细胞数是否增加。

（二）、显微镜直接计数法

1.镜检计数室，熟悉计数器的使用方法

2.对稀释5倍的啤酒酵母悬液进行计数

3.注意：

（1）血球计数板必须洗干净，勿刷

（2）注意勿损坏计数器

计数原则：

1、稀释浓度要合适，每个小方格5-10个酵母菌

2、压线的酵母菌，一般计上和右

3、对于出芽的菌体，如果芽体超过母体的一半，算2个菌

实验结果：在四十倍的显微镜下可看到啤酒酵母菌呈单个的椭球形细胞，以出芽的形式进行无性繁殖，其芽体和母体连在一起。还可看到，有的酵母菌呈蓝色，为死细菌，有的酵母菌呈无色，为活细菌，并且随着时间的推移，死细菌在增多。

参考文献：

微生物学实验（第三版）沈萍范秀容李广武主编

微生物学实验讲义张琪

2011年10月7

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