探讨骨髓间质干细胞与心脏病的治疗

探讨骨髓间质干细胞与心脏病的治疗摘要：心血管疾病导致的心功能障碍广泛分布并为成人发病率和死亡率增加的重要因素。

一般认为，机体缺少心肌修复和再生的有效的内在机制，心肌细胞无增殖分化能力，受损后不能再生，只能由成纤维细胞填充，最终为瘢痕组织替代，并逐步发生心室重构形成慢性心力衰竭。

传统的药物、介入治疗等虽然保护了心功能，患者生活质量亦提高，但并不能从根本上逆转心血管疾病引起的心肌细胞数量减少；心脏移植则由于供体来源少、风险大、排斥反应等难以广泛开展。

干细胞移植有可能取代受损心肌细胞，增加有功能的心肌细胞数量，并建立新的血管来供应血运，为心肌梗死（MI）的治疗开辟了一条新途径。

骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是存在于骨髓中的非造血干细胞，具有来源广、取材方便、免疫原性低、易于分离和体外培养扩增、易于外源基因的导入和表达、可进行基因修饰、能分化为心肌细胞和内皮细胞等优势，成为心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞。

关键词：心血管疾病1 BMSC向心血管组织细胞分化大量实验数据表明，BMSC一旦暴露于多种生理或非生理性刺激下，进一步分化的细胞显示心肌样细胞的几种特征。

在这些条件下，体外分化的BMSC 显示出肌管样结构和时间依赖性同步跳动特性；电子显微镜分析揭示这些细胞具有心肌细胞样超微结构包括典型的肌小节，中心位核和心房颗粒；并呈现发育心肌细胞的几种功能特征包括肽类物质的产生、多重结构收缩性蛋白的表达；它们也显示出至少具有窦房结样和心室样细胞兴奋能力[1-3]。

已明确介质和直接的细胞与细胞之间的接触均可诱导BMSC分化为心肌细胞。

通过与人类心肌细胞共培养，已经证实干细胞可以获得心肌细胞样的表型特征为表达重链肌球蛋白、β及肌钙蛋白T。

然而，当BMSC在心肌细胞条件培养基下培养时，仅能观察到β表达。

因此，细胞与细胞之间的直接接触对于促使BMSC分化为心肌细胞基因谱系的心肌环境或微环境的信号传递是必须的。

而且，人BMSC呈现出细胞与细胞之间的相互偶联并通过特殊的缝隙连接与心室肌细胞偶联[4，5]。

实验观察到培养的心房和心室肌心肌细胞与从BMSC分化而来的心肌细胞样细胞具有惊人的细胞及分子相似性，为更好地理解原始成体细胞和BMSC源性心肌细胞之间的细胞对话迈出了重要的一步。

已证实BMSC不仅可分化为心肌细胞，同时还可以分化为血管平滑肌细胞或其前提细胞（vSMC/PC）、祖细胞和内皮细胞。

这些细胞类型均与血管系统发生有关，包括血管的生成和扩张。

研究表明，新vSMC/PC形成出现在血管周围间质干细胞分化后，呈现血小板源性生长因子依赖性过程；随后又发现, 在心肌内注射BMSC 后，组织病理学和免疫组织化学分析揭示注入的细胞分化为心肌细胞、vSMC/PC 和内皮细胞，同时可观察到血管密度的增加。

与此相似，给慢性缺血的狗心肌内注射BMSC可产生血管供应增加的效应并改善心功能。

免疫荧光分析揭示，内皮细胞和平滑肌细胞出现共区域化，与肌细胞却不存在共区域。

因此，这些数据表明BMSC成为心梗后病人大量心血管组织细胞成分的一个理想的供体来源。

BMSC分化为心肌细胞继发新生血管形成和心功能改善的机制与BMSC引起的生长因子的旁分泌有关[8-10]。

已经证实，FGF2，一种主要的有丝分裂蛋白，是由BMSC产生，并分别刺激定型和未定型的BMSC持续休眠和增值[11]。

未定型的BMSC代表休眠前体的少数细胞群，而定型和成熟的BMSC产生大量的终末分化的间质细胞系[12]。

以上阐述BMSC 具有分化为几种心脏表型细胞的潜能，多数情况是根据冰冻组织样本的免疫组织学分析显示固定细胞的细胞系的特殊细胞标志的共区域化的实验依据为基础。

到目前为止，还没有证实BMSC 注入后在受体心脏检测到的已明确的免疫表型是肌原性和（或）血管细胞系分化的真正显示且不是假象。

在骨髓干细胞可塑性研究方法学进一步发展后，相似的观点已引起广泛争议。

因此，目前有必要借助一种合适的可确保实验结果准确、可重复及稳定的方法学检测进行BMSC分化为心肌细胞的研究。

此将有助于避免不必要的争议诸如骨髓造血干细胞横向分化为心脏表型细胞继而影响心肌再生[13，14]。

2 临床前研究啮齿动物如羊、狗、猪或猴梗死模型的实验研究表明，多种类型细胞进行心脏移植是可行的且有助于改善梗死心肌的收缩功能[15]。

这些细胞类型包括自体同源的未纯化的骨髓、骨髓单核细胞、纯化的骨髓来源的细胞(CD34+ 和（或）CD113+)、心肌细胞、成纤维细胞和肌原细胞。

虽然可以变更移植方法（经心肌内、冠状动脉内或静脉）、移植细胞的数量和受体的心脏状态，但移植后的免疫或毒性反应仍然不能检测。

BMSC也已被认为是心脏疾病细胞治疗的潜在的备选细胞。

BMSC移植的有效效应取决于它们具有呈时间依赖性和特殊的组织亲和性的方式植入受体组织。

由于心脏组织是BMSC最先的目的地，因而提出BMSC注入可能在心梗后重塑、血管发生及瘢痕形成的病理生理过程中起很重要的作用。

关于这一点, 临床前研究数据证实冠状动脉内或心肌内注入后，移植的 BMSC 继续存在于心肌内并经过微环境依赖性的心肌基因型分化；移植入的细胞显示心肌细胞表面标志物的重新表达，诸如β肌球蛋白重链、α肌动蛋白、心脏肌钙蛋白T和受磷蛋白。

而且，移植细胞发育为含纹状肌原纤维肌球蛋白重链的肌纤维及细胞与细胞之间的结点[16，17]。

由于猪和人的心脏解剖结构相似，因而用作MI和全身心血管疾病研究的模型。

应用此模型, 可以获取到注入的BMSC进入正常和梗死的心肌组织的轨迹和短暂及长期移植的心脏效应的有价值的信息。

借助于磁共振荧光透视检查技术，研究者们已经确定梗死和正常组织界限的标志性区域，指导心肌内BMSC注射。

除此以外，正常和梗死的心肌组织内注入的铁荧光粒子标记的BMSC在移植后跳动心脏已获许检测[18，19]。

应用猪的这种模型，已确定心肌内移植后2周标记的BMSC的有效移植已经出现并伴几种肌特殊蛋白的共表达。

这种现象意味着BMSC随之分化为心肌样细胞，2周后伴随收缩功能不良的显著缓解，同时，心肌壁变薄显著减轻。

在心肌重塑期间，一个重要的问题是与细胞再生安全可行的程序的优化有关。

应用大动物模型（如羊、狗、猪），大多数研究者证明心肌内注入祖细胞到梗死区域是安全和可行的。

在猪模型上进行的有关BMSC的实验，心肌内注入细胞（104～108）被证实是安全的而且没有检测到免疫和其他的毒性反应[18，19]。

心肌内注入BMSC操作的安全性的进一步证据在犬慢性缺血模型上得到证实。

证实犬接受心肌内注入BMSC(总细胞数为1×108) 存活阶段无并发症且未显示心率失常、心脏波变化或Q波起始变化等体征。

而且，由于心肌激酶和肌钙蛋白 I 水平在最初的轻度上升后又下降到基础水平，心肌损害亦可除外，组织病理学分析也显示无MI存在。

然而，心肌内注入BMSC 的安全性已经受到挑战。

最近的研究揭示正常犬冠脉动脉内注入犬BMSC(10 ×106)后出现急性心肌缺血和亚急性心肌微梗死[20]；这些进一步的心脏变化发生的原发损害是由于大量(18～20μl) BMSC 引起的血管阻塞导致的缺血状态所致。

由于此项颇有影响的研究不包括插入导管但未接受细胞移植的对照组犬，因而很难确定是细胞大小、导管插入术本身还是其他因素[21]是引起心肌缺血和微梗死的器质性始动因素。

有关冠状动脉内注入干细胞的安全性和有效性，Wollert’s 研究结果则得出与成长期个体包括人体研究相反的结论[22]。

这些临床前试验在MI病人上可能产生的影响难以估计。

从操作安全性看，任何人均可假定在猪身上进行的研究所获得的安全性数据都可能与人相关。

然而，毫无疑问的是，有必要进行更多的研究[23]。

从功效看，结果显示BMSC 时间依赖性的贮留、移植、迁移和分化，强化了MSC移植是缺血性心力衰竭的一种替代治疗的观念。

3 临床研究近几年，开始了几项临床研究以评定急性MI后移植自体细胞在心肌再生方面的影响。

大部分研究中修复细胞来源为异体骨髓细胞成分，命名为骨髓源性单核细胞。

至少包含几种细胞亚群：淋巴细胞、早期骨髓细胞、内皮原始细胞及极低含量的造血干细胞和或BMSC。

除了该种来源的修复细胞外，骨髓细胞的大多数纯化成分如含CD34+或CD133+表面标记的原始细胞及骨肌原细胞也被用于严重的心梗后左心室机能障碍。

在所有上述这些研究中，自体修复细胞通过冠状动脉内、心肌内或经心外膜途径施于。

结果表明，从恢复梗死心肌灌注率方面而言，植入操作是安全、可行和有效的[22，24]，后者大多数情况归因于中存在的内皮原始祖细胞[25]和或分泌的血管源性生长因子引起的血管事件[26-28]。

虽然在动物模型中积累了大量关于BMSC分化和应用的信息，但在心肌梗死的病人中进行评定心脏功能效应的临床试验仍然很少。

最近，Chen 等[29]组织进行了一项随机性研究以观察急性MI病人冠脉内注入BMSC 后的效应。

在梗塞形成相关的冠状动脉阻塞后，自体BMSC混悬液通过附有金属丝的可膨胀的气囊式导管直接注入目标冠状动脉。

心动描记值显示接受BMSC 治疗组与对照组有显著差异。

治疗组病人运动功能减退、运动不能及运动障碍百分率下降，心梗区周围心室壁的运动速率和左心室射血分数显著提高。

Chen 等[29]报告证明总的左室射血分数显著和持续提高，其强度甚至大于注入造血细胞后，表明MSC的注入在人心脏触发了新的心肌细胞形成和新血管发生[16]。

另外，证实冠脉内注入BMSC 不会产生任何以前所报道的细胞大小相关的不良反应[20,30]。

在一项前瞻性非随机化Ⅰ期临床试验中，评定了冠脉搭桥术(CABG)病人心肌内注入自体BMSC 和 MNCs混合物的可行性、安全性和有效性。

患MI及因持续缺血宜作CABG术的病人纳入本研究范畴。

骨髓从研究组病人中抽取并且处理用于分离和扩增BMSC。

第二次的骨髓抽取于手术当天（研究组）并用于制备MNCs。

一旦所有的冠状动脉动脉旁路吻合完成，BMSC 和MNCs的混合物即沿着梗死边缘四周注入。

所有病人在此操作程序后都存活下来并且没有出现手术并发症。

注入细胞后，血清标记物的突然增高并未检测到。

手术后4个月，心脏磁共振影像学分析揭示接受细胞注入治疗的患者总的左室射血分数较基础值及对照组病人增加。

而且，细胞治疗的病人MI体积显著减小。

虽然研究的病人有限而且从细胞移植效应中分离出手术效应也很复杂，但是这些结果仍然能够表明注入自体的BMSC 和的混合物是可行、安全和极其有利的。

应用“修复细胞”混合物取代单一细胞类型的原理在于以下的依据。

首先，是内皮祖细胞的一个重要来源[25]。