蛋白质芯片技术.ppt
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纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在 蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋 白质-小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合 蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。
（四）微阵列设计与制备
1 人工制备芯片
主要有两种 ,即手工点样和免疫打点印迹装置。 存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样 品和捕获分子消耗大和敏感性较低
特点ห้องสมุดไป่ตู้
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便 宜；容量较小；容易发生交叉污染
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 不易蒸发；可以用于多步反应，但是有其较 固定的缓冲条件；造价昂贵；容量较大；不 易发生交叉污染
微孔板上构建的 可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 蛋白质芯片 不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容 量较大；不易发生交叉污染
列点样在芯片上，进行杂交反应。 2.有活性芯片： 把生物体直接点在芯片上，并原位
表达蛋白质。 ? 按形式分类 1.玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建） 2.3-D 胶芯片（在多孔凝胶垫上构建） 3.微孔芯片（在微孔板上构建）
不同种类的蛋白质芯片的特点
类别
玻璃表面构建的 蛋白质芯片
多孔微胶垫上构 建的蛋白质芯片
蛋白质芯片技术
目录
一 蛋白质芯片技术产生的背景 二 蛋白质芯片的概念 三 蛋白质芯片的主要特点 四 蛋白质芯片的分类 五 蛋白质芯片技术的简要操作步骤 六 蛋白质芯片的应用
一 蛋白质芯片技术产生的背景
随着人类和其他生物的全基因组序列的 完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗 传信息的载体，而生命活动的执行者、表观 性状的体现者则由基因编码的产物—蛋白质 所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞 合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均 发 生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质 参与，所有的外在表现均由种类繁多的蛋白 质所决定。
五 蛋白质芯片技术的简介
操作步骤
1
提出生物学问题
（实验目的）
蛋白质芯片制备
6 数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间，
冲洗条件
4 药物筛选、药代动力学研究。
5 在毒理学中的应用。
6 环境监测。 7 食品卫生安全的监测。
（一）蛋白质芯片的制备
一 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）
二 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解
三 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等
四 固定微阵列上的蛋白样点
膜为载体：芯片放入湿盒,37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白
2 微阵列制备仪
主要有直接接触式和非接触式两种类型 ,也是目前市 场上常用的两种方法
（五）抗原或抗体的标记
1 酶标记
常用的标记酶有辣根过氧化物酶 (HRP) 、碱性磷酸 酶(AP)等.
2 荧光物标记
荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、 丹磺酰氯、罗丹明 β -异硫氰酯等。
（六）蛋白质芯片检测方法
蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质 阵列在一种高密度的固相载体上，并与 待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性 质、特征以及蛋白质与生物大分子之间 的相互作用的方法。
三 蛋白质芯片的主要特点
1.高通量 2.灵敏度较高 3.重复性好 4.操作自动化
四 蛋白质芯片的分类
? 按蛋白质性质分类 1.无活性芯片： 将已经合成好的蛋白质以高密度阵
? 随着分子生物学技术的发展，生物芯 片技术研究工作不断深入， DNA芯片技 术被逐渐用于对生物样品中核酸序列 表达的检测和比较研究。
? 随着DNA芯片技术的不断成熟，以及基 因研究所取得的令人瞩目的成果，进 一步推动 蛋白质功能的研究及相关技 术的发展 ，蛋白质芯片技术因此应运 而生。
二 蛋白质芯片的概念
六 蛋白质芯片的应用
1 用于蛋白质 -蛋白质、蛋白质 -核酸、 蛋白质-脂类等相互作用研究；特异性 蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。
例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋 白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷 脂酰肌醇的结合蛋白。
2 疾病诊断的研究。 目前，临床上应用的蛋白质芯 片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它 的应用范围主要在以下几个方面：
五 微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA
（二）抗原抗体的固化
1 化学性固定
化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属 离子、混合离子等
2 生物性固定
生物性配基包括受体、配体、酶、抗体 -抗原等
（三）捕获分子
1 抗体
由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一 种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰 度及确定新的蛋白质。
2 寡聚核苷酸
适配体,即寡聚核苷酸 能够作为捕获分子用于连接蛋白质， 并且有很高的特异性和亲和力。
3 肽样寡聚体
鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系 统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。
4 小分子配体
制备捕获分子最为有效的方式
小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行
5 重组蛋白
1 以质谱技术为基础的直接检测法
如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOFMS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场力的作 用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比,用以 分析蛋白质的分子量和相对含量。
2 蛋白质标记法
常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集 各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,即 可以获得有关生物信息。
（1）用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监 测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。
（2）用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要 是指 45岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢 性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民 等。
（3）用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究。
3 抗体筛查 。例如， 对噬菌体抗体库一 次可对 上万 个不同的抗体克隆进行检 测。
（四）微阵列设计与制备
1 人工制备芯片
主要有两种 ,即手工点样和免疫打点印迹装置。 存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样 品和捕获分子消耗大和敏感性较低
特点ห้องสมุดไป่ตู้
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便 宜；容量较小；容易发生交叉污染
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 不易蒸发；可以用于多步反应，但是有其较 固定的缓冲条件；造价昂贵；容量较大；不 易发生交叉污染
微孔板上构建的 可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 蛋白质芯片 不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容 量较大；不易发生交叉污染
列点样在芯片上，进行杂交反应。 2.有活性芯片： 把生物体直接点在芯片上，并原位
表达蛋白质。 ? 按形式分类 1.玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建） 2.3-D 胶芯片（在多孔凝胶垫上构建） 3.微孔芯片（在微孔板上构建）
不同种类的蛋白质芯片的特点
类别
玻璃表面构建的 蛋白质芯片
多孔微胶垫上构 建的蛋白质芯片
蛋白质芯片技术
目录
一 蛋白质芯片技术产生的背景 二 蛋白质芯片的概念 三 蛋白质芯片的主要特点 四 蛋白质芯片的分类 五 蛋白质芯片技术的简要操作步骤 六 蛋白质芯片的应用
一 蛋白质芯片技术产生的背景
随着人类和其他生物的全基因组序列的 完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗 传信息的载体，而生命活动的执行者、表观 性状的体现者则由基因编码的产物—蛋白质 所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞 合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均 发 生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质 参与，所有的外在表现均由种类繁多的蛋白 质所决定。
五 蛋白质芯片技术的简介
操作步骤
1
提出生物学问题
（实验目的）
蛋白质芯片制备
6 数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间，
冲洗条件
4 药物筛选、药代动力学研究。
5 在毒理学中的应用。
6 环境监测。 7 食品卫生安全的监测。
（一）蛋白质芯片的制备
一 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）
二 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解
三 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等
四 固定微阵列上的蛋白样点
膜为载体：芯片放入湿盒,37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白
2 微阵列制备仪
主要有直接接触式和非接触式两种类型 ,也是目前市 场上常用的两种方法
（五）抗原或抗体的标记
1 酶标记
常用的标记酶有辣根过氧化物酶 (HRP) 、碱性磷酸 酶(AP)等.
2 荧光物标记
荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、 丹磺酰氯、罗丹明 β -异硫氰酯等。
（六）蛋白质芯片检测方法
蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质 阵列在一种高密度的固相载体上，并与 待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性 质、特征以及蛋白质与生物大分子之间 的相互作用的方法。
三 蛋白质芯片的主要特点
1.高通量 2.灵敏度较高 3.重复性好 4.操作自动化
四 蛋白质芯片的分类
? 按蛋白质性质分类 1.无活性芯片： 将已经合成好的蛋白质以高密度阵
? 随着分子生物学技术的发展，生物芯 片技术研究工作不断深入， DNA芯片技 术被逐渐用于对生物样品中核酸序列 表达的检测和比较研究。
? 随着DNA芯片技术的不断成熟，以及基 因研究所取得的令人瞩目的成果，进 一步推动 蛋白质功能的研究及相关技 术的发展 ，蛋白质芯片技术因此应运 而生。
二 蛋白质芯片的概念
六 蛋白质芯片的应用
1 用于蛋白质 -蛋白质、蛋白质 -核酸、 蛋白质-脂类等相互作用研究；特异性 蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。
例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋 白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷 脂酰肌醇的结合蛋白。
2 疾病诊断的研究。 目前，临床上应用的蛋白质芯 片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它 的应用范围主要在以下几个方面：
五 微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA
（二）抗原抗体的固化
1 化学性固定
化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属 离子、混合离子等
2 生物性固定
生物性配基包括受体、配体、酶、抗体 -抗原等
（三）捕获分子
1 抗体
由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一 种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰 度及确定新的蛋白质。
2 寡聚核苷酸
适配体,即寡聚核苷酸 能够作为捕获分子用于连接蛋白质， 并且有很高的特异性和亲和力。
3 肽样寡聚体
鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系 统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。
4 小分子配体
制备捕获分子最为有效的方式
小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行
5 重组蛋白
1 以质谱技术为基础的直接检测法
如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOFMS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场力的作 用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比,用以 分析蛋白质的分子量和相对含量。
2 蛋白质标记法
常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集 各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,即 可以获得有关生物信息。
（1）用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监 测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。
（2）用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要 是指 45岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢 性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民 等。
（3）用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究。
3 抗体筛查 。例如， 对噬菌体抗体库一 次可对 上万 个不同的抗体克隆进行检 测。