间接免疫荧光试验
间接免疫荧光法检测自身抗体
(二)实验操作的标准化滴定平板技术
实验标准化流程为滴加样品、标记抗体至加样板，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。因为液体被局限在一封闭的空间，不再需要传统“湿盒”，可同时在一致的反应条件孵育大量的标本。下面以间接免疫荧光法为例，介绍滴定平板技术的操作过程：
间接免疫荧光法保留了原基质的完整抗原谱，因而可同时检测大量抗体．获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体)，或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时，就应该选择免疫荧光法。另外，应用免疫荧光法还可检测到一些至今未知的抗体。
在没有荧光显微镜时，可尝试用酶标记的第二抗体代替荧光标记的抗体，但是检测的质量会明显下降。因为在免疫荧光法中，指示剂染色是通过抗体直接结合在细胞抗原上产生的，而免疫酶法，染色则是弥散地围绕在抗原周围的区域。因此免疫酶法并不总是像免疫荧光法那样能区分抗原分布的细小差别。而且应用酶染色时，会导致许多自身抗体不能被区分或根本测不到。仅应用细胞核制备物免疫酶染色的纯光度法评价也是不可取的，因为这不可避免地导致一些自身抗体被漏检。
9．封片加甘油／PBS至盖玻片，每一反应区约10ul。从pBS-Tween缓冲液取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间鲸。将盖玻片轻轻盖在载片上。
10．结果判断 荧光显微镜下观察荧光。
(三)抗体检测的质量控制及注意事项
l．质量控制 自身抗体检测的质量控制是用多种手段对自身抗体存在与否、浓度的多少进行控制和评价，有利于实验室内部、实验室之间对同一标本获取相同具有可比性的结果，是衡量实验室检测水平的一个重要指标。然而．自身抗体检测的质量控制，并不是一件容易的工作。因为不同实验室所用的抗原基质存在差异、抗原的固定方法有差异或不同，血清的稀释方法不同以及操作者对不同荧光模式的识别能力不同等，均可影响到自身抗体的检酒质量。实验室在进行临床检测时，应同时检测阳性对照、阴性对照，以监测结果的准确性。国内急需成立专门的学术机构，参照国际标准，与国际接轨，建立自己当地的标准，开展自身抗体检测的质量控制。
《间接免疫荧光实验》课件
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
《间接免疫荧光法》课件
06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育 时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干 扰，解决方案是使用去内源性荧光 物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决 方案是使用更稳定的荧光物质或采 用避光染色技术。
研究展望
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03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如 自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞 内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真 菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和 污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术 ，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染 色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和 诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实 验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体 ，间接免疫荧光法能够特异地 识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定 位抗原的位置，有助于了解抗 原在细胞或组织中的分布情况 。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免 疫荧光法能够直观地展示抗原 的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可 获得，该方法可能无法应用。
间接免疫荧光
间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
间接免疫荧光实验
通过观察荧光强度，可以初步判断抗原表达量， 为定量分析提供参考。
定量与定性分析
定量分析
通过测量荧光强度或计数阳性细胞数 量，对实验结果进行定量分析，得出 抗原表达水平的相对值。
定性分析
根据荧光显微镜下观察到的抗原定位 、细胞形态以及荧光强度，对实验结 果进行定性分析，判断抗原是否存在 以及表达情况。
实验局限性及改进方向
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实验过程中可能存在假阳性或 假阴性结果，需要进一步优化
实验条件和操作流程。
实验方法的灵敏度和特异性仍 需进一步提高，以适应更广泛
的应用场景。
需要加强实验质量控制，确保 实验结果的稳定性和可靠性。
针对不同抗原和样本类型，需 要进一步探索和改进实验方法 ，以提高其适用性和通用性。
02 实验材料
抗体选择与制备
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抗体来源
选择来源于特异性免疫动 物的抗体，如小鼠、兔、 羊等。
抗体纯化
通过亲和层析、凝胶过滤 等方法对抗体进行纯化， 去除杂蛋白和聚合物。
抗体标记
选择荧光染料对抗体进行 标记，常用的荧光染料有 FITC、TRITC、Cy3等。
细胞或组织样本
细胞培养
将细胞在适宜的培养基中培养， 保持细胞活性。
06 参考文献
参考文献
[请在此处插入参考文献1] [请在此处插入参考文献2]
[请在此处插入参考文献3]
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实验步骤
间接免疫荧光实验通常包括细胞或组织固定、抗体孵育、洗涤、加入荧光标记的第二抗体 、再次洗涤和荧光显微镜观察等步骤。
实验注意事项
在进行间接免疫荧光实验时，需要注意控制实验条件，如温度、pH值和抗体浓度等，以 保证实验结果的准确性和可靠性。同时，需要注意荧光标记物的选择和使用，以及避免非 特异性染色等问题。
间接免疫荧光法测ANA课件
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟。
实验步骤八: 冲洗
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液, 流水冲洗载片, 然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小 杯中浸洗至少5分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl) 伊文氏蓝进行复染。
然后再进行下一个载片的操作。
实验步骤十: 结果判断
➢荧光显微镜下观察荧光。
结果判读:
荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞, 不发
荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性, 否
则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
【均质型】 细胞核呈均匀一致的荧光
【核仁型】 核仁部分呈现荧光
某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富
ANA检测的意义
有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；
观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理
【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
✓滴度定义: 与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察 到特异性荧光反应的最高稀释度
【临床意义】
总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一 个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫 性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测 各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病 情观察、预后及治疗评价有重要意义。
未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－ 100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混 合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁 性肝硬化等。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
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六、操作步骤
1、病毒吸附：5%cpv同步接毒，3d 2、丙酮固定：80%丙酮，4 ℃,1h 3、洗涤：用 PBS 洗涤3遍 ∕ 3min 4、加入一抗：加入抗 CPV 阳性血清（1：100倍稀 释），200μL/孔，37℃湿盒中作用 3h 5、洗涤 6、加入二抗：加入 FITC 标记羊抗鼠 IgG 二抗 （1:300倍稀释）50μL，37℃闭光作用 1h； 7、洗涤 8、镜检：荧光显微镜观察，拍照，有绿色荧光者判 为阳性，无荧光者判为阴性。
二、常见荧光素特性
1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射 光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。 3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm， 橙红色荧光。 4）镧系：Eu、Tb 5)PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。 6）其它：酶作用后产生荧光物质。
七、图示
三、分类
直接免疫荧光法
间接免疫荧光法
四、应用
将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制， 待病价最高的时候进行间接荧光免疫实 验 用于分毒时，确定有无病毒的存在 测抗体
五、优缺点及注意事项
优点：特异性高、敏感性高、速度快 缺点：非特异性染色 注意事项：
1、每次试验应设阳性和阴性对照 2、应注意荧光抗体的质量 3、标本应避光保存
间接荧光免疫实验
2013307341 叶ห้องสมุดไป่ตู้苹
一、原理
根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原 或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用 这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查 细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细 胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧 光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受 激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或 桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织， 从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利 用定量技术测定含量。