免疫荧光方法[1]
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
小胶质细胞免疫荧光实验操作方法
小胶质细胞免疫荧光实验操作方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
细胞免疫荧光步骤[1](干货分享)
](https://img.taocdn.com/s3/m/ba3d4b9c336c1eb91b375d28.png)
细胞免疫荧光步骤方法一:1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片)2.然后在4％PＦA里面室温下固定30分钟，ＰBＳ洗两次，0.1％TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的pａrａfilm,在上面滴上稀释在1％ＢSＡ/TＢＳ中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片３0ul 足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育３0分钟，然后在PBＳ里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上ｍounting medium(大约每个玻璃片加10uｌ)，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WＢ检测一下你的抗体,看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rａbｂiｔ和rａt的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是ｄonｋｅy ａｎtｉ—rabbiｔ－FITC（绿）和doｎkey anti-ｒat-Ｔｅx－Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是1０％的正常donｋey血清.5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作.方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片,还有直接在2４welｌ/12well/９6wｅll中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
免疫荧光实验的实验操作步骤及注意事项
免疫荧光1.免疫荧光所用玻片的处理(1) 玻片的规格：圆形18mm×18mm可放入12孔盘；(2) 处理方法：将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗，，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。
完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。
临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。
2. 铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。
多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸干液体，紫外照射5-10min，晾干。
实验前一天将含2-3×10^4细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。
每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12~24h后，用于实验分析；3. 固定用PBS洗涤细胞3 次(注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的)，吸干，4%的PFA 1ml/ 孔于室温固定10min ；4. 防淬灭吸出PFA ，注意不能使细胞干燥，用PBS 洗3 次，加入1ml 的50mM 氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS 洗3 遍，2-3min/次；(此步可省略)5. 通透加入1ml 的0.1%Triton X-100，10min，吸出Triton，用PBS 洗3 次，2-3min/次；6. 封闭加入1ml 3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA ，用PBS 洗10min；7. 一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20μl ，单染加40μl ）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h 或4°C 过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS 洗4 次，10min/次；8.二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h, 将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；9. DAPI染细胞核一般浓度为1μg/ml，每个盖玻片需20ul ，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；10.封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
直标抗体免疫荧光方法
直标抗体免疫荧光方法是免疫荧光技术的一种，主要用于检测细胞的表面抗原。
此方法的特点是采用已知的抗体来检查未知的抗原，通常需要使用冰冻切片技术，将病变组织如红斑狼疮、疱疹样皮炎、类天疱疮等进行冰冻切片，然后利用荧光标记的抗体与抗原发生特异结合的原理，使其呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原部位和性质。
此外，在抗体与抗原结合的过程中，需要注意细胞和抗原的保存和结构完整性，以确保抗体能够与其正确结合。
因此，在进行直标抗体免疫荧光实验时，通常需要采用适当的缓冲液和去垢剂处理细胞，以保证其结构和功能的完整性。
同时，为了提高实验的特异性和敏感性，还需要对抗体进行优化选择。
通常会通过调整抗体的稀释比例、选择合适的缓冲液和封闭液等方法来实现。
总的来说，直标抗体免疫荧光方法是一种高度特异性和敏感性的抗原检测技术，广泛应用于医学研究和临床诊断中。
但需要注意的是，该实验技术的结果易受多种因素影响，如抗体的特异性、细胞的处理方式、缓冲液和去垢剂的选择等。
因此，在进行实验时需进行严格的控制和标准化操作。
免疫荧光 标准方法
免疫荧光标准方法一、样品制备1. 选取适当的组织样品，用冷丙酮固定，并保存在-80°C。
2. 将样品切成5μm厚的切片，放置在载玻片上。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用3%的H2O2在室温下处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用0.1%的Triton X-100在室温下处理切片10分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
二、免疫荧光染色1. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭切片，室温下放置30分钟。
2. 取出切片，用特异性一抗溶液封闭切片，4°C孵育过夜。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用荧光二抗溶液封闭切片，室温下孵育1小时。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用DAPI染色液染色核，室温下孵育5分钟。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
8. 用抗荧光淬灭封片液封片，避免强光照射。
三、观察和记录1. 用荧光显微镜观察切片，记录荧光信号的位置、强度和分布情况。
2. 对每个样本至少观察三个不同的视野，并记录数据。
四、结果分析1. 根据荧光信号的位置、强度和分布情况进行分析。
2. 可使用图像分析软件进行定量分析。
3. 根据分析结果进行数据处理和统计。
五、标准化1. 采用阳性对照和阴性对照作为内标。
2. 阳性对照应呈现强烈的荧光信号，阴性对照应无荧光信号。
3. 对所有样本进行标准化处理，以保证结果的可靠性。
六、质量控制1. 实验过程中应避免交叉污染和样品间的干扰。
2. 对实验数据进行及时记录和分析，确保数据的准确性和完整性。
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免疫荧光方法免疫荧光(Iｍｍｕnofｌｕorｅscｅｎce, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体)。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术（比如流式细胞仪)测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等.细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步,细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片(Ｓｌides or Cｏverｓｌips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门,非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法,合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的.免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Wｅstern Bloｔ）中的相同步骤是类似的,最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或—20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果....感谢聆听...由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像ＷB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨的实验对照。
总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。
...感谢聆听...基本实验步骤：（1) 细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）２次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
...感谢聆听...（2) 固定.根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的ＰBS中4℃保存3个月.PＢS洗涤3×5 min。
（3）通透。
使用交联剂(如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-１5mｉn.通透后用ＰBS洗涤3×５ mｉn。
（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30miｎ.（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜.ＰＢＳT漂洗3次，每次冲洗5min。
（6) 二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗.室温避光孵育1h。
PＢST漂洗３次,每次冲洗5ｍin后,再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
(一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞,也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入ｃovｅrｓlips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。
少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
...感谢聆听...（二）固定和通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定.固定的目的有三:①防止细胞从玻片上脱落;②除去防碍抗原—抗体结合的类脂；③使标本易于保存。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质;③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。
通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。
有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。
交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连,从而产生一种抗原相互连接的网络结构。
交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合,可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本.两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
...感谢聆听...最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。
通常,细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。
细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
...感谢聆听...通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。
但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。
相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,则不需要进行通透。
丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。
甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。
常用的通透剂是去垢剂,如Triｔoｎ，NＰ-40，以及Twｅｅn ２０, Sapｏｎｉn， Dｉgiｔoｎin 和 Leｕcoperm等。
Ｔｒiｔon和N Ｐ—40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。
但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白,从而影响实验结果。
Triｔon Ｘ-1００是最常用的通透剂,但是它将破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜相关抗原。
后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过,但是不会溶解细胞质膜。
适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
...感谢聆听...一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定,这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白,从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号.固定后以冷ＰB Ｓ液漂洗,最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
...感谢聆听...（三）封闭封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合,最常用的封闭剂为1% ＢＳA， PBS pH 7.５,其他可选择的封闭剂还有 1％ gelａtｉn，１％boｖｉnｅ或与二抗种属相同的血清(3－1０%）等....感谢聆听...（四)抗体孵育直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体,因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。
此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
(五）封片及荧光观察标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察,特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。
但在绝大多数情况下,为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等,需作封片处理。
常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂....感谢聆听...（六）标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性.因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。
由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃)下保存相当长的时间。
在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存,在需要时再进行荧光标记,即随用随染。
...感谢聆听...直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水(PBS）：0.01mｏl/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0。
０1moｌ/L,ｐH7。
4的PBS进行稀释缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH９。
2 0.2M 碳酸盐缓冲液１份配制搪瓷桶三只(内有０.０1ｍoｌ/L,pH７。
４的PＢS 1５00ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H３７℃温箱等。
实验步骤１、滴加０.0１mol/Ｌ，pＨ7．4的PＢS于待检标本片上，10ｍin后弃去，使标本保持一定湿度。
２、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间(参考：30mｉｎ)。
3、取出玻片，置玻片架上,先用0．01mol/Ｌ，pＨ７.４的PBS冲洗后,再按顺序过０．01mｏl/L，ｐH7．４的PBＳ三缸浸泡，每缸３—5 ｍｉｎ，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
５、立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+"表示:（—)无荧光；（±)极弱的可疑荧光；（+)荧光较弱，但清楚可见;（+＋）荧光明亮;（+＋＋－-++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“＋+”以上,而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从1０ miｎ到数小时，一般3０ｍiｎ已足够。
染色温度多采用室温（２5℃左右)，高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用０-2℃的低温,延长染色时间。
低温染色过夜较３7℃３0 miｎ效果好的多。
...感谢聆听...3、为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
(1）标本自发荧光对照：标本加1—2滴0．０1mol/L，pH7。
４的ＰBS。
(２）特异性对照(抑制试验）:标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
（３）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。