分子生物学实验报告
分子生物学实验总结报告
实验总结报告摘要1、通过PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳回收得到外源基因parb,进行BglⅡ和Xba I 双酶切；抽提质粒pIJ86601，进行BamH I和Xba I 双酶切；将两者的酶切产物通过连接转化，培养后抽提质粒进行电泳，测序，检测重组质粒是否构建成功。
测序结果显示未构建成功。
2、用相同的方法构建表达载体PGEX-sco3330，由于时间问题尚未完成。
3、诱导蛋白表达，蛋白纯化，蛋白脱盐，bradford法进行蛋白含量测定以及SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验（Western Blotting）。
实验内容：一、构建质粒pIJ86601-parb(一)获取外源基因parb1.PCR扩增PCR体系：200µl体系中，高保真pfuDNA聚合酶10X buffer，40 µl；10mM Mixed dNTP，5 µl；PrimerA，5 µl；PrimerB，5 µl；高保真pfu酶，2 µl；DMSO，20 µl；双蒸水，120 µl；模板1μl。
PCR程序设定Temp[℃] Time next turns Gradient[℃]1: 98.0 10min2: 98.0 30S3: 60.0 30S 30.04: 72.0 30S 2 3 45: 72.0 10min6:16.0 1h2.琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA1)通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块,放入1.5ml离心管中。
2)按每300µl/100mg的比例加入Binding Buffer,置于50-60℃水浴中10分钟,使胶彻底融化。
加热融胶时，每2分钟混匀一次。
3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm室温离心2 min。
4)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500µl WashSolution,12,000 rpm室温离心30秒。
分子生物学试验报告
分⼦⽣物学试验报告分⼦⽣物学实验报告实验⼀真核基因组DNA的制备与分析⼀、实验步骤1、材料处理（1）取0.5cm的⽼⿏尾巴组织块，⽤⽣理盐⽔洗净，剪碎⾄糜状。
（2）将上述组织碎末加⼊盛有500uL裂解液的2mL离⼼管中，37℃⽔浴1h。
2、⽤蛋⽩酶K和苯酚处理细胞裂解液（1）加50uL蛋⽩酶K，温和的将酶混⼊粘滞的溶液中。
（2）将裂解细胞的悬浮液置于55℃⽔浴3h，不时的温和旋动该粘滞溶液，⾄看不到明显的组织块为⽌。
（3）将溶液冷却⾄室温，加500uL的Tris平衡酚，缓慢的来回颠倒离⼼管⾄两相混合形成乳浊液，于室温以5000g离⼼10min，使两相分开。
（4）⽤⼤⼝径移液管将上层粘稠的⽔相移到⼀洁净的离⼼管中，⽤酚重复抽提2次。
（5）第三次酚抽提后，将⽔相移⾄另⼀离⼼管中，于室温加100uL的10M⼄酸铵和1000uL 的⼄醇，转动离⼼管使溶液充分混合，DNA⽴即形成沉淀，通常可⽤吸管将沉淀从⼄醇溶液中移除。
如果DNA沉淀为碎⽚，则与室温离⼼收集。
（6）DNA沉淀⽤70%的⼄醇洗涤，离⼼收集。
将离⼼管于室温下放置实验台上，直⾄⼄醇挥发殆尽。
不要使DNA沉淀完全⼲燥，否则极难溶解。
（7）待沉淀将近透明后加适量的TE溶解DNA，通常需要12-24⼩时使DNA完全溶解，将DNA 溶液存于4℃.3、DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1）制备0.6%的琼脂糖凝胶。
（2）取适量DNA样品，与凝胶上样缓冲液混合，加⾄上述凝胶上样孔内。
（3）取适量标准DNA溶液同样加⾄凝胶上样孔内。
（4）电泳，电压为1V/cm，距离以阳极⾄阴极为准。
（5）电泳结束后，将凝胶放⼊含溴化⼄锭（0.5ug/mL）的⽔中室温浸染10min，⽤紫外灯观察凝胶和照相。
⼆、实验结果如上图所⽰，基因组DNA在0.6%琼脂糖凝胶上跑出30kb左右的单⼀条带（λDNA/Hin d III Marker），但有个别组的样没有明显的条带出现。
三、结果分析提取的基因组DNA⽚段只有30kb左右，偏⼩。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告分子生物学实验报告引言分子生物学是一门研究生物大分子结构、功能和相互作用的学科，通过实验手段揭示生命现象的分子机理。
本实验旨在探究DNA复制过程中的关键步骤，以及RNA转录和蛋白质翻译的基本原理。
实验一：DNA复制DNA复制是细胞分裂过程中必不可少的步骤，它保证了遗传信息的传递和维持。
本实验通过模拟DNA复制过程，研究DNA复制酶的作用和复制的准确性。
材料：- DNA模板- DNA聚合酶- 引物- dNTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、DNA聚合酶、引物、dNTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察DNA复制产物。
结果：通过凝胶电泳分析，我们观察到DNA复制产物的出现。
这表明DNA聚合酶能够在模板DNA上合成新的DNA链，并且复制的过程较为准确。
讨论：DNA复制的准确性是生命传递遗传信息的基础。
DNA聚合酶具有校正功能，能够识别和修复错误的碱基配对。
这种精确性保证了基因组的稳定性和可靠性。
实验二：RNA转录RNA转录是将DNA信息转录成RNA的过程，它是基因表达的第一步。
本实验旨在研究RNA转录的机制和调控。
材料：- DNA模板- RNA聚合酶- 引物- NTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、RNA聚合酶、引物、NTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察转录产物。
结果：凝胶电泳分析显示出RNA转录产物的出现。
这表明RNA聚合酶能够在DNA模板上合成RNA链。
讨论：RNA转录是基因表达的第一步，它决定了细胞内特定基因的表达水平。
RNA聚合酶通过与DNA模板的互作用，选择性地合成特定的RNA链。
这种选择性转录是基因调控的关键。
实验三：蛋白质翻译蛋白质翻译是将RNA信息翻译成蛋白质的过程，它是生物体内蛋白质合成的关键步骤。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
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PCR扩增HBV-S1.实验原理1.1采用PCR扩增出HBV-S基因。
PCR是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶促扩增技术。
其前提是一对人工合成的15-20bp的寡核苷酸引物，其序列与待扩增的DNA两侧的碱基序列互补。
PCR包括下列三个基本步骤：变性、复性、延伸。
经过上述变性、退火、延伸步骤的25-35次循环，导致特异的靶序列的2n指数扩增。
1.2此次扩增的目的基因用于后续的表达，为了保证碱基不发生错配，不采用无矫正功能的Taq酶，而用高保真酶。
1.3为了使目的基因能和载体正确连接，本次实验选择在目的基因末端加尾（A）的方法。
2.实验目的获得HBV-S基因，为后续克隆做准备。
3.实验材料3.1模板3.2 PCR扩增引物3.3二甲基亚砜3.410×PCR 缓冲液（含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2 15mmol/L 、KCl 500mmol/L, pH8.3，0.1%明胶）3.5脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成10mM- dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。
）3.6水：要求不含DNA聚合酶抑制剂，不含离子，一般为去离子二蒸水（ddH2O）, 灭菌以后即可使用。
4.实验仪器4.1PCR仪Thermo Hybaid4.2水平式琼脂糖凝胶电泳槽4.3恒压电泳仪Bio-Rad4.4凝胶成像仪JY04S—3C北京君毅东方4.5垂直流超净工作台上海智域分析仪器制造有限公司4.6微量加样器5.1获得模板5.1.1取100ul血清，加入50ul裂解液，颠倒混匀，100℃金属浴10min；5.1.2 12000rpm的转速下离心5min；取2ul作为模板。
5.2扩增HBV-S基因（PCR）5.2.1PCR体系材料体积5*buffer 2.5mMdNTP Phire模板HBV-S1 HBV-S2 ddH2O总体积4ul 1.6ul 0.4ul 2ul 1 ul 1 ul 10ul 20 ul5.2.2 PCR设置参数1）98℃预变性30s；2）98℃变性5s、60℃复性5s、72℃延伸10s，循环30次；3）72℃终延伸1min.6.琼脂糖凝胶电泳6.1量取100ml5×TBE电泳缓冲液加蒸馏水至1000ml，配置成0.5×TBE电泳缓冲液；6.2称取琼脂糖3g，加入0.5×TBE电泳缓冲液200ml，加热熔化，当凝胶冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭溶液5ul，充分混匀；6.3先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在5～10mm左右）；6.4在凝胶完全凝固后，小心移去透明胶带，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，再小心取出梳子；6.5取已制备好的DNA样品10ul，加入染料2ul，充分混匀后用移液器将样取加入点样孔，在另一点样孔中，加入maker10ul；6.6盖上电泳槽，打开电源，电泳40～60分钟；（注意：DNA样品从负极向正极泳动）；6.7将凝胶置于紫外仪下观察；将剩余的10ul保存于4℃扩增的HBV-S基因片段长度为750bp框内所标识的条带为本组实验结果（从左置右，前两管的引物体积为1ul，后两管的引物体积为0.5ul）。
分子生物学实训报告
一、实训背景分子生物学是研究生物大分子如蛋白质、核酸的结构与功能的一门学科。
随着生命科学技术的不断发展，分子生物学在医学、农业、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
为了更好地理解和掌握分子生物学的基本理论和技术，我们开展了为期两周的分子生物学实训课程。
本次实训旨在通过实际操作，加深对分子生物学理论知识的理解，提高实验技能，培养科研素养。
二、实训目的1. 熟悉分子生物学实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、酶切、电泳等分子生物学实验技术。
3. 理解基因克隆、基因表达、蛋白质分析等分子生物学实验原理。
4. 提高团队协作和沟通能力，培养科研素养。
三、实训内容1. 实验室基本操作与安全规范（1）熟悉实验室布局，了解各种仪器的使用方法。
（2）学习实验室安全操作规程，掌握实验室废弃物处理方法。
（3）进行实验前的准备工作，如配制试剂、消毒、无菌操作等。
2. DNA提取（1）了解DNA提取的原理和常用方法。
（2）学习酚-氯仿法提取DNA。
（3）对提取的DNA进行质量检测，如A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳等。
3. PCR扩增（1）了解PCR扩增的原理和步骤。
（2）设计PCR引物，进行PCR反应。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 酶切（1）了解酶切原理和酶切反应条件。
（2）学习限制性内切酶的用法。
（3）进行酶切反应，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 电泳（1）了解电泳原理和电泳技术。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等电泳技术。
（3）对DNA、蛋白质等生物大分子进行电泳分离和检测。
6. 基因克隆、基因表达、蛋白质分析（1）了解基因克隆、基因表达、蛋白质分析的基本原理。
（2）学习相关实验技术，如载体构建、重组表达、蛋白纯化等。
（3）对克隆的基因、表达的蛋白进行检测和分析。
四、实训过程1. 实验前准备（1）查阅相关文献，了解实验原理和操作步骤。
（2）配制实验试剂，确保实验用品齐全。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告实验目的：探究基因在DNA复制过程中的作用及其表达机制。
实验材料与方法：材料：1. DNA模板：提取自大肠杆菌细胞中的质粒DNA。
2. DNA聚合酶：用于合成新的DNA链。
3. 引物：用于DNA聚合酶的引导和定向合成DNA。
4. dNTPs：脱氧核苷酸三磷酸盐，提供新的核苷酸单位供DNA聚合酶使用。
方法：1. DNA复制反应：将DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs混合在一起，加入适量缓冲液和镁离子，并在适温条件下进行DNA复制反应。
2. DNA扩增：通过PCR技术，利用引物的特异性，从DNA模板中扩增目标序列。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分离和检测PCR产物，通过电泳迁移率差异判断扩增产物的大小。
实验结果：1. DNA复制反应成功进行，获得了新的DNA链。
2. PCR反应成功扩增目标序列，观察到明显的放大带。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示PCR产物的大小符合预期。
实验分析与讨论：本实验通过模拟DNA的复制过程，成功合成了新的DNA链，并通过PCR技术扩增了目标序列。
这一结果验证了基因在DNA复制过程中的作用。
在DNA复制过程中，DNA聚合酶是关键的酶类。
DNA聚合酶能够识别DNA的模板链，并根据模板链的信息合成新的互补链。
在实验中，添加了引物和dNTPs，引物可以定向和引导DNA聚合酶的合成，dNTPs则提供了能量和碱基单位，支持DNA聚合酶的复制活动。
PCR技术是一种重要的生物分子技术，其通过引物的特异性识别和引导，扩增目标序列。
实验中，选择了适当的引物序列，使其能够与目标序列特异性地结合，并保证扩增反应的特异性和选择性。
PCR反应可以在短时间内扩增大量的目标DNA序列，为后续的分析和研究提供了足够的样品。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分析方法，通过电场驱动DNA分子在凝胶中迁移，根据分子大小的差异来判断扩增产物的大小。
在实验中，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示出明显的PCR产物带，与预期的目标序列大小相符，说明PCR扩增反应成功，目标序列得到了扩增。
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分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
二、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法，用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序，的DNA碱裂解法。
并利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。
学习掌握琼脂糖凝胶电泳这种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的基本原理和操作方法。
使用限制型内切酶进行DNA酶切。
了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
掌握菌落PCR法鉴定重组质粒DNA，了解菌落PCR法鉴定菌落及保存的操作方法。
学会用IPTG阻遏蛋白诱导GFP基因表达。
三、实验原理1、质粒DNA的分离与纯化质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。
质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。
当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。
借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。
（1）细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。
对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。
但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
（2）菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。
（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。
这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。
此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。
通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
（3）质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。
质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC 构型）和线性分子（L构型）。
在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。
在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。
2、质粒DNA浓度的测定核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度。
3、琼脂糖凝胶电泳影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小：双链DNA 分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。
分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。
（2）琼脂糖浓度：给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。
在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。
（3）DNA的构象：超螺旋环状（℃型）、切口环状（℃型）和线状（℃型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。
其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和℃型超螺旋绞紧的程度或密度。
一些条件下，℃型DNA比℃型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。
（4）所用的电压：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。
电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。
所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。
要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm 。
（5）电泳缓冲液：DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。
缺乏离子则电导率降低，DNA 或者不动或者迁移很慢。
高离子强度时（如10×buffer ），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA 变性。
4、酶切及连接迄今已发现了3000多种限制性内切酶。
传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。
II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA 链。
它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA 分析和克隆的一类。
II 型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I 、Hind III 、BamHI 和Not I 这样在识别序列中进行切割的酶。
这一类酶是构成商业化酶的主要部分。
大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA 上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA 上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列（如EcoR I 识别GAATTC ；Hind III 识别AAGCTT;BamHI 识别G↓GATCC; Not I 识别GC↓GGCCGC ）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC ）。
限制性内切酶酶切DNA 后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I 酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端，如HaeIII 酶切后产生DNA 连接酶能够催化在两条DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA 链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH ），和在另一条DNA 链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P ）。
5、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化外源DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。
感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，5’-G ↓AATTC-3’ 3’-CTTAA ↓G-5’ 5’-GG ↓CC-3’ 3’-CC ↓GG-5’。
ligas e 5’ 3’ 5’ 3’此时的细胞即呈现为感受态。
这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。
制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。
在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90s）诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。
6、重组质粒DNA的鉴定——菌落PCR法单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。