蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2基因的克隆与表达分析
蛋白修饰研究策略分析（四）丨蛋白修饰相关的蛋白功能分析
蛋白修饰研究策略分析（四）丨蛋白修饰相关的蛋白功能分析我们除了要对蛋白修饰进行检测，还要把蛋白修饰与蛋白功能结合起来进行分析才能真正阐明蛋白修饰对蛋白功能的影响。
下面我们介绍一下与蛋白修饰分析有关的常见策略和方法。
1.对蛋白修饰位点的氨基酸进行点突变磷酸化修饰常常发生的氨基酸残基包括丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）。
对于氨基酸位点的突变，以氨基酸的结构、空间位阻和电荷的相似性或差异性为基础，一般遵从下列规律：制备功能失活型突变体，常常会把原来的氨基酸残基替换为结构差异比较大的氨基酸残基。
例如，会把丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A），而把酪氨酸（Tyr，Y）突变为苯丙氨酸（Phe，F）。
在命名和标记上会用原来的氨基酸名称+氨基酸位点数字+突变后的氨基酸名称来表示，如S312A，代表把某一个蛋白的第312位Ser突变为Ala。
而制备功能组成型激活突变体，会把Ser、Thr或Tyr突变为一些酸性氨基酸，如谷氨酸（Glu，E）或天冬氨酸（Asp，D）。
在研究泛素化修饰的时候，大多数都要制备功能失活型突变体，而泛素常常偶联的氨基酸残基是赖氨酸（Lysine，K），按照氨基酸突变的规律，常常会把可能被泛素化的潜在目的蛋白的赖氨酸（Lysine，K）位点突变为精氨酸（Arginine，R）。
而在进行多泛素偶联的研究时，会利用泛素表达载体、泛素连接酶表达载体以及被泛素化的潜在目的蛋白表达载体（分别带有不同标签）进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析，这时常常会考虑泛素之间的连接位点，如K48位多泛素连接，就会在构建泛素表达载体时，把泛素短肽当中除K48位以外的所有其他赖氨酸位点都突变为精氨酸，我们把这种表达载体为泛素化位点特异性表达载体，类似的位点特异性表达载体还有K63、K11、K27、K29等不同位点特异性泛素表达载体。
当然，也会只单单把泛素短肽当中可能进行多泛素化连接的位点（如K48、K63、K11、K27、K29等不同位点）突变为精氨酸（Arginine，R），以干扰在这个位点进行多泛素化连接，这样就可以更清楚某一个位点进行多泛素化连接的作用。
泛素蛋白连接酶Itch生物活性及其免疫调节作用
唐冰, 等. 泛素蛋白连接酶 Itch 生物活性及其免疫调节作用
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使免 疫 突触 寿 命降 低, T 细 胞 与抗 原提 呈 细 胞 ( APC) 的结合变得不稳定, 从而使 T 细胞反 应性 降低甚至无反应性, 维持 T 细胞的失能。It ch 缺 失大鼠会出现脾大、淋巴细胞浸润等自身免疫综合 征的表现, 其分子机制可能是 T 细胞过度活化, 即失能缺失。 1. 3 Notch 受体 N ot ch 蛋白( 哺乳动物含有四种) 是一种保守的 型跨膜受体[ 6] , 对 T / B 淋巴细胞 的分化具有重要作用, 其中包括 T h2 的分化。另 外, 通过上调抗凋亡蛋白 A KT 、Bcl 2 以及活化凋 亡蛋白抑制因子( IA P) , No tch 能够增加外周成熟 T 细胞的活性和寿命。
收稿日期: 2011 03 01 作者简介: 唐冰( 1977 ) , 男, 主治 医师, 博 士, 主要 从事临 床麻 醉药理的机制研究。 通讯作者: 王俊科( E mail: junke45@ yah oo. com )
肺泡蛋白沉积引发的低氧血症。 1. 1 Jun 蛋白家族 是 It ch 调节 T 淋巴细胞分化 的分子基础。T 细胞受体( T CR) 激活后, JunB 能 够启动 IL 4 启动子, 使 T 细胞向 T h2 分化。现已 证实, c Jun 和 JunB 均是 It ch 的底物蛋白[ 4] 。在 生理条件下, It ch 的 WW 域可与 c Jun 和 JunB 结 合, 催化其泛素化并经溶 酶体和蛋白酶 体途径降 解, 使 IL 4 等细胞因子持续处于相对较低活性, 减少 T 细胞向 T h2 分化。在 It ch 基因突变或表达 下调时, JunB 表达紊乱, IL 4 等细胞因子表达增 加, T 细胞向 T h2 分化增加, T 细胞过度增 生, 发生异常免疫反应, 如血清 IgG 1和 Ig E 持续升高。 因此, It ch 缺失大鼠多存在 CD4+ T 淋巴细胞的功 能紊乱。 1. 2 PLC 和 PKC Itch 是 T 细胞失能的决定 子。所谓失能( anergy ) 是指 T 细胞遭遇 抗原时处 于功能失活状态, 在这种低反应状态下 T 细胞仍 能长时间保持细胞活力。泛素介导免疫反应中关键 信号分子的降解, 能够打 破细胞免疫突 触的完整 性, 从而保证 T 细胞受到再次刺激时表现为免疫 耐受。
植物含跨膜域RING E3泛素连接酶研究进展
植物含跨膜域ＲＩＮＧＥ３泛素连接酶研究进展孙林静 张融雪 苏京平 王胜军 佟 卉 刘燕清 孙 癑（天津市农作物研究所，天津３００３８４）［摘 要］ Ｅ３泛素连接酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｅｎｚｙｍｅ）能识别底物蛋白并将其泛素化，导致底物蛋白通过２６Ｓ蛋白酶体进行降解，是调节蛋白水平的重要因子。
植物Ｅ３泛素连接酶在调控激素响应、参与形态建成、抗病防御反应和非生物胁迫响应方面起着重要作用。
ＲＩＮＧ（ＲｅａｌｌｙＩｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇＮｅｗＧｅｎｅ１）家族是含环指结构（ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒｄｏｍａｉｎ）的Ｅ３泛素连接酶家族，一般定位于细胞核。
含有跨膜结构域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ，ＴＭＤ）定位于膜的ＲＩＮＧＥ３泛素连接酶（ＴＭＤ－ＲＩＮＧ）是该家族中较为特殊的亚家族。
通过对植物中含有跨膜域ＲＩＮＧＥ３泛素连接酶的研究进展进行总结，以期为此类基因研究提供借鉴和帮助。
［关键词］ 泛素；Ｅ３泛素连接酶；环指结构；跨膜域ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＰｌａｎｔＲＩＮＧＥ３ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＬｉｇａｓｅｗｉｔｈＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅＤｏｍａｉｎＳｕｎＬｉｎｊｉｎｇ ＺｈａｎｇＲｏｎｇｘｕｅ ＳｕＪｉｎｇｐｉｎｇ ＷａｎｇＳｈｅｎｇｊｕｎ ＴｏｎｇＨｕｉ ＬｉｕＹａｎｑｉｎｇ ＳｕｎＹｕｅ（ＴｉａｎＪｉｎＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＬｉｇａｓｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅａｎｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｈｉｃｈｌｅａｄｔｏｓｕｂｓｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａ ｄａｔｉｏｎｂｙ２６Ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＬｉｇａｓｅｓａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＰｌａｎｔＥ３ｕｂｉｑ ｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔ ａｎｃｅａｎｄｄｅｆｅｎｓｅ，ａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＲＩＮＧｆａｍｉｌｙｉｓａｃｌａｓｓｏｆＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｆａｍｉｌｙｗｉｔｈＲＩＮＧｆｉｎ ｇｅｒｄｏｍａｉｎ，ｇｅｎｅｒａｌｌｙｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ．ＴｈｅＲＩＮＧＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ（ＴＭＤ）ｗｉｔｈｍｅｍｂｒａｎｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｓａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｐｅｃｉａｌｓｕｂｆａｍｉｌｙ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＴＭＤ－ＲＩＮＧＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｉｎｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｉｔｉｓｈｏｐｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｐａｐｅｒｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅａｎｄｈｅｌｐｆｏｒｔｈｅｒｅ ｓｅａｒｃｈｏｆＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｕｂｉｑｕｔｉｎ；Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅ；ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒｄｏｍａｉｎ；ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ基金项目：国家重点研发计划（２０１７ＹＦＤ０１００５０５）；转基因重大专项（２０１６ＺＸ０８００１００４－００２）第一作者简介：孙林静（１９７１－），女，黑龙江佳木斯人，天津市农作物研究所杂交粳稻研究中心副研究员。
泛素26S蛋白酶体途径与显花植物自交不亲和反应
植物学通报 2006, 23 (2): 197￣206收稿日期: 2005-09-27; 接受日期: 2005-11-28基金项目: 国家自然科学基金(30371189)和国家863计划(2001AA246102)* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: lyhshen@．专题介绍．泛素／２６Ｓ蛋白酶体途径与显花植物自交不亲和反应于晓敏 蓝兴国 李玉花＊(东北林业大学花卉生物工程研究所 哈尔滨 150040)摘要 植物的生长和发育离不开短命调控蛋白的有选择性降解, 其中一种重要的降解方式就是泛素/26S 蛋白酶体途径。
在这个途径中, 泛素(ubiquitin)和26S 蛋白酶体起着至关重要的作用, 需要被降解的蛋白会通过E1-E2-E3酶接合反应由Ub 进行标记, 随后标记蛋白会被26S 蛋白酶体识别并降解。
自交不亲和反应也正是通过此途径实现的, ARC1(arm repeat containing 1)和SCFs (skp1-cul1-F-box-proteins)作为E3s 分别在孢子体自交不亲和和配子体自交不亲和反应中起作用。
本文综述了就泛素/26S 蛋白酶体途径的组成及其在自交不亲和反应中的作用。
关键词 26S 蛋白酶体, 蛋白质水解, 泛素, 自交不亲和性The Ub/26S Proteasome Pathway and Self-incompatible Re-sponses in Flowering PlantsXiaomin Yu, Xingguo Lan, Yuhua Li *(Research Institute of Flower Biotechnology , Northeast Forestry University , Harbin 150040)Abstract Plant growth and development is generally controlled by selective removal of short-lived regulatory proteins. One major pathway is represented by the ubiquitin (Ub)/26S proteasome pathway.In this pathway, ubquitin and 26S proteasome play essential roles. Ub is attached to proteins des-tined for degradation by a 3-step enzymatic (E1-E2-E3) conjugation cascade, and the resulting Ub-protein conjugates are then recognized and degraded by the 26S proteasome. The arm repeat-con-taining 1 (ARC1) and the skp1-cul1-F-box (SCF) proteins, belonging to the family of E3 Ub ligases,function in both the sporophytic and gametophytic self-incompatible responses, respectively. This review highlights the recent progress toward understanding the role of the Ub/26S proteasome pathway during self-incompatible responses.Key words 26S proteasome, proteolysis, ubiquitin, self-incompatibility新多肽的形成和前体蛋白的水解控制着植物生活的所有方面。
E3泛素连接酶Arkadia的结构特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的应用
E3泛素连接酶Arkadia的结构特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的应用本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！引言泛素化降解是真核细胞内蛋白质降解的主要途径, 可调控细胞凋亡、转录调控、细胞周期、DNA损伤修以及免疫应答等多种细胞活动, 该途径具有依赖ATP、高效、高度选择性的特点. 其中, E3泛素连接酶Arkadia是泛素化降解过程的关键酶. 目前已知的研究报道,Arkadia可以特异性泛素化降解细胞内蛋白, 在纤维化疾病、肿瘤的发生发展及转移、气管重塑等多种疾病发病过程中都发挥着重要的作用. 本文就Arkadia研究进展综述如下1 泛素化概述泛素最早是在1975年被发现的, 他是一种分子量仅为kDa的小分子调节蛋白, 由76个氨基酸组成. 其广泛表达于哺乳动物细胞内, 同时在细菌、酵母及高等植物体内也广泛表达, 在酵母和人类之间仅有3个氨基酸的差异, 因而具有高度的保守性. 泛素可以单体形式存在,也可与靶蛋白形成复合物直到1982年, Ciechanover等对泛素化进行了更为具体的描述. 泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下, 对靶蛋白进行特异性修饰的3步酶学反应过程. 首先, E1泛素激活酶通过水解ATP获得能量, 激活泛素分子, 进而实现泛素分子与E1泛素激活酶的共价结合; 然后在E2泛素结合酶的协助下, 泛素分子由E1泛素激活酶传递给E2结合酶; E3泛素连接酶再将与E2泛素结合酶共价结合的泛素分子传递给靶蛋白, 靶蛋白经过多次泛素化过程, 被多个泛素分子标记, 形成多聚泛素链; 最终, 被多聚泛素链所标记的靶蛋白被26S 蛋白酶体降解为小分子的多肽片段, 同时释放游离的可重新利用的泛素分子. 在体内, 泛素化为一动态过程, 与其他转录后修饰过程一样, 可影响细胞内的多个信号传导过程. 泛素化与去泛素化能否保持一定的平衡对于维持机体正常的生理状态具有非常重大的意义.2 E3泛素连接酶Arkadia的结构特征E3泛素连接酶决定了靶蛋白底物的特异性, 是泛素化过程中起决定作用的关键. 目前,已知的E3泛素连接酶有600多种, 根据其结构和功能的不同, 可以分为4类: HECT结构域E3酶、RING结构域E3酶、N末端规则E3酶、及环指相关E3酶[. Arkadia是一种环形E3泛素连接酶, 广泛表达于成年哺乳动物组织中,如包括睾丸、脾脏、胰腺、肺脏、肾脏、肝脏及心脏等. 2001年Niederländer等[30]及其同事首先对Arkadia进行了报道, 他们的研究发现Arkadia可增强Nodal信号通路, 诱导Node分子形成, 这在胚胎早期发生过程中发挥着非常重要的作用.Arkadia是由994个氨基酸开放阅读框架构成的蛋白, 编码基因为RNF111 ; 他具有泛素结合酶的RING结构域及靶蛋白识别结构, 其N-末端时多个核定位信号, C-末端即是具有特征性结构-RING finger结构域. RING-finger 结构域是指70个氨基酸中的8个氨基酸(半胱氨酸和组氨酸)通过与锌离子螯合作用形成C3H2C3(RING-H2)或C3HIC4(RING-HC)构型.其氨基酸序列为: Cys-X2-Cys-Xn(9-39)-Cys-Xl~3-His-X2~3-Cys-X2-Cys -Xn(4-48)-Cys-X2-Cys(C2HC4)(X可以是任何氨基酸残基, 但在特定的位置还有特定的氨基酸残基), Cys 和His分别代表锌结合残基半胱氨酸和组氨酸, 并且每一环指结构域连有两个锌离子.3 Arkadia在信号通路中的作用/Smad信号通路中的作用b Arkadia在TGF- ,b(transforming growth factor-b Arkadia是一种细胞内蛋白, 可以通过泛素化降解细胞内蛋白而发挥增强转化生长因子)信号通路的作用. 与其他E3泛素连接酶所不同的是,Arkadia与Smad1、Smad2、Smad4、Smad5、Smad8分子不存在相互作用,bTGF- 信号通路中的抑制性分子,b仅与Smad6、Smad7具有较强的相互作用; 而Smad6分子主要在BMP信号通路发挥重要作用. Smad7分子是TGF- 、activin、nodal信号通路的激活. 因此,b超家族的Ⅰ型受体相结合, 抑制Smad2、Smad3的活化, 从而抑制TGF-b可以与TGF- 信号通路的转录活性主要是通过泛素化降解Smad7分子而实现的. 除Smad7分子以外,bArkadia增强TGF- Arkadia还可以通过降解P-Smad2/3分子发挥增强Nodal 信号通路的作用.另外, Arkadia还可以降解c-Ski/SnoN, 信号通路下游靶基因的转录. 例如,在胚胎细胞中,b去除非活化状态的R-Smad复合体, 使得活化状态的R-Smad复合体与靶基因相结合, 进而促进TGF- 信号通路下游基因的转录.因此,bArkadia的表达缺失虽可募集P-Smad2/3分子, 但却不能启动TGF- 通路的抑制因子, 如Smad7、C-ski及SnoN,b/Smad信号通路, 主要是通过泛素化降解TGF-bArkadia参与调节TGF- 信号.b来放大TGF- Arkadia在骨形态发生蛋白-7/Smads信号通路中的作用超家族的成员之一,在细胞增殖及成骨细胞分化的过程中都发挥着非常重要的作用. 其中, Smads蛋白是骨形态发生蛋白-7(boneb BMPs是TGF- morphogenetic protein-7,BMP-7)/Smads信号通路下游重要的调节因子. 首先, BMP-7蛋白与丝氨酸/苏氨酸激酶Ⅰ型和Ⅱ型受体结合形成多聚复合物, 而后结合Smads蛋白(如Smad1/5/8)发挥信号传导作用.Smad6及Smad7是BMP-7/Smads信号通路中重要的抑制分子, 信号通路的抑制分子.b构成一个重要的负反馈的环路; 其中Smad7既是BMP-7/Smads信号通路的抑制分子, 又是TGF- 信号通路的抑制作用相对较弱, 却可以有效地阻断BMP-7/Smads信号通路.b但Smad6对于TGF- Tsubakihara等的研究揭示了在BMP诱导成骨细胞分化过程中, Arkadia的缺失会导致成骨细胞分化明显减少. 他们的研究表明Arkadia主要通过降解Smad6来发挥正向调控BMP-7/Smads信号通路的作用.Arkadia在EGF信号通路中的作用Arkadia信号通路, 在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)信号通路中也发挥着重要的作用.b不仅仅可以调控TGF- Mizutani等研究发现, Arkadia可以与AP2复合体u2亚基的C-末端相结合, 促进u2亚基的泛素化, 进而可以调节内皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor, EGFR)的介导的内吞作用. 因此,Arkadia可以通过调节EGFR的内吞作用来发挥调控EGF信号通路的作用.4 Arkadia在疾病发生发展中的作用Arkadia与纤维化Arkadia信号通路相关疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用.b/Smads信号通路, 故Arkadia在与TGF-b 能有效地增强TGF- 是纤维化发生过程中的关键因子, 因此, Arkadia可能会参与纤维化发生发展的过程. Liu 等的研究指出,bTGF- 刺激之后, Arkadia的mRNA表达水平明显升高, 而且用小干扰RNA干扰掉Arkadia 之后,b人的正常肾小管上皮细胞在TGF- -SMA)的表达水平出现明显的降低,a-smooth muscle actin, a-平滑肌肌动蛋白(a肾脏因此Arkadia在肾小管上皮细胞间质转化过程中有着非常重要的作用; 他们的另一项研究发现: 在肾小管间质纤维化的大鼠模型中, Smad7的mRNA水平升高, 但蛋白水平却降低, 他们认为Arkadia可以通过降解Smad7促进肾小管上皮细胞向间质细胞转化; Gai等的研究也进一步证实了Arkadia 可以促进间质上皮转化这一观点.Arkadia与肿瘤Arkadia与消化系肿瘤: Arkadia在消化系肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用. Sharma等研究发现Arkadia在鼠的结肠上皮细胞中表达量较高, 且在Arkadia缺失的小鼠患结直肠癌的风险远远大于野生型小鼠; 因此Arkadia作为一种肿瘤抑制因子可以有效的抑制结直肠癌的发生发展. 同时, 信号通路而实现的. 此外,b他们认为Arkadia这一抑制结直肠癌发生发展的作用主要是通过募集SnoN分子抑制TGF- 在20种人类肿瘤细胞中也检测到Arkadia的泛素化表达, 因此认为Arkadia或许参与弥漫性胃癌的发展过程.Arkadia与肺部肿瘤: 体外研究[56]发现,Arkadia 在肺肿瘤细胞NCI-H460中稳定表达, 且可明显地抑制该细胞的生长; 但在体外实验中,Arkadia却不能抑制小鼠肺部肿瘤的发展. 另有研究报道Arkadia可以加速乳腺癌及肺癌鼠的肿瘤转移, 其主要机制是因为Arkadia可以降解c-Ski, 从而发挥促进间质上皮转移的作用;Briones-Orta等利用3种不同的肿瘤细胞进行了研究, 研究发现Arkadia被干扰之后, 肿瘤细胞在肺内的定植明显受到抑制, 他们得出这样的结论: Arkadia虽不能调控肿瘤的生长, 但在肿瘤细胞的定植及早期转移过程中却有着举足轻重的作用.Arkadia与气管重塑哮喘是一种气道慢性炎性疾病, 反复发作的炎症反应致使气管重塑, 作为一种致纤维化因子,b主要表现为上皮下纤维化形成、肌细胞增生、上皮损伤、杯状细胞化生、水肿及新生血管增加. TGF- 信号通路的调控因子, 在气管重塑过程中发挥着重要的作用.b而Arkadia作为TGF- 信号通路, 进而促进气管重塑.bLi等发现Arkadia通过降低Smad7、noN/Ski蛋白表达可以显著增强TGF- 他们的研究结果预示着Arkadia或许可以作为气管重塑治疗的新的切入点, 但是具体的机制还有待于更深入的研究.5 结论信号通路的作用;b信号通路转录活性, 继而放大TGF-bArkadia具有增强TGF- 还可以通过降解Smad6分子起到增强BMPs/Smad信号通路的作用, 同时也可以发挥调控EGF信号通路的作用. 此外, Arkadia在人类多种疾病的发生发展过程中都发挥着举足轻重的作用. 以上结果预示着Arkadia或许可以作为疾病治疗的新靶点, 但是其在疾病发生发展中的具体作用还有待于进一步的深入研究.本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！。
周氏啮小蜂CcGSTS1基因的克隆·蛋白表达纯化及酶学特征分析
（大连）有限公司；引物合成及测序由苏州金唯智生物科技有
限公司完成；其他如氯仿、异丙醇等试剂均为国产或进口分
析纯试剂。
菌种及质粒：大肠杆菌 Ｔｒａｎｓｅｔｔａ （ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍ⁃
ｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｔｒａｎｓ１ － Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃｈｏｕｉｏｉａ ｃｕｎｅａ Ｙａｎｇ；Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ⁃ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ；Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
昆虫的宿主适应性及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白
１－十二烯对小蜂已交配雌性具有较强的引诱性，但其诱发周
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ， ＡＢＣ ）、 细 胞 色 素 ｐ４５０ （ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ，
和线粒体 ＧＳＴｓ。 迄今为止，在昆虫中只发现了胞质 ＧＳＴｓ 与
ｓｉｌｏｎ、Ｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｔａ 和 Ｚｅｔａ
［５］
。 普遍存在于原核生物和
真核生物中谷胱甘肽 Ｓ－转移酶，除对内源性和外源性化合
物的解毒作用以外，还参与多种细胞生理生化反应，如胞内
１．１ 材料 供试昆虫：周氏啮小蜂，由河南省漯河市豫中南
３４０ ｎｍ 处的吸光值，分别于 １ ｍｉｎ 和 ６ ｍｉｎ 各测定 １ 次，按照
１００ ｍｇ，用液氮研磨后，按照 ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２ 结果与分析
据反转录试剂盒说明书进行反转录反应获得单链 ｃＤＮＡ。
ＣｃＧＳＴＳ１ 基因，该基因全长 ４７４ ｂｐ，编码 １５７ 个氨基酸。 应用
薯蓣皂苷靶向泛素-蛋白酶体的抗肿瘤活性研究
doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2023.23.0326薯蓣皂苷靶向泛素-蛋白酶体的抗肿瘤活性研究李欣茹，王嘉琦，柯细松，周香莲Dioscin Inhibits Ubiquitin-Proteasome System in Cancer Cells LI Xinru, WANG Jiaqi , KE Xisong, ZHOU XianglianCenter for Chemical Biology, Institute of Interdisciplinary Integrative Medicine Research, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, ChinaCorrespondingAuthor:KEXisong,E-mail:*******************.cn;ZHOUXianglian,E-mail:************************.cn柯细松 博士，研究员，博士生导师，上海市高层次海外人才，上海中医药大学学术荣誉体系讲席教授，中药化学生物学研究中心主任，上海中医药大学上海高水平地方高校战略创新团队带头人。
长期致力于创新抗肿瘤靶向药物发现和基于靶标的药物作用机制研究，尤其是针对“不可成药”肿瘤治疗靶标的药物发现。
以通讯作者在Nat Chem Biol 、Cell Reports 、Proc Natl Acad Sci U S A 和Cancer Res 等知名学术期刊发表系列研究论文，并被Trends Biochemical Sci 和Trends Pharmacol Sci 等国际著名期刊邀请发表多篇综述论文。
担任国际药学领域知名期刊Pharmacological Research 编委，以及Nature Chemical Biology 、Cell Reports 、Nature Comm 、Cell Chem Biol 和Trends Pharmacol Sci 等20余种学术期刊审稿人。
泛素连接酶E3 和肿瘤关系的研究进展
1342
实 用 医 学 杂 志 2009 年 第 25 卷 第 8 期
用 ，或 者 抑 制 HDM2 的 表 达 。 ARF ／ p14 可 以 与 HDM2 结 合 ，促 进 HDM2 的 降 解 ，稳 定 p53。 ARF 衍 生 的 肽 段 可 以 用 来 抑 制 HDM2 。 ［19－20］ 3．2 IAP （inhibitor of apoptosis protein）E3
由于泛素连接酶和肿瘤关系密切， 因此它可以作用肿瘤治疗的新靶点。 理 想的肿瘤治疗靶点必须满足以下几个条 件：它在肿瘤发生中发挥重要作用；抑制 它的活性可使细胞生长受阻或细胞凋 亡；药物容易到达；它在正常细胞中不表 达或低表达， 抑制它的活性对正常细胞 影 响 很 小 。 有 几 种 E3 比 较 符 合 上 述 条 件。 3．1 HDM2 （human counterpart of Mdm2） E3 HDM2 在 正 常 组 织 中 表 达 很 低 ， 而 在一些肿瘤中高表达，包括乳腺癌、软组 织 肉 瘤 、食 管 癌 、肺 癌 等 。HDM2 的 直 接 靶 分 子 是 p53，HDM2 和 p53 结 合 ， 发 挥 E3 的 活 性 ，促 进 p53 泛 素 化 降 解 。 HDM2 表 达 越 高 ，肿 瘤 预 后 越 差 。 抑 制 HDM2 的 活 性 ，可 以 恢 复 p53 的 功 能 ，促 进 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 。 所 以 HDM2 是 很 好 的 作 用 靶 点 。 由 于 缺 乏 HDM2 特 异 性 的 抑 制 剂 ，因 此 ， 常 用 的 策 略 是 干 扰 HDM2-p53 的 相 互 作
IAP E3 家 族 蛋 白 都 含 有 一 个 或 几 个 BIR 结 构 域 ，能 够 抑 制 凋 亡 。 IAP 家 族 至 少 有 8 个 成 员 ，XIAP、CIAP-1、CIAP-2、 TsIAP、NIAP、Survivin、Livin、Apollon。 其 中 抗 凋 亡 能 力 最 强 的 是 XIAP，它 能 抑 制 caspase。 与 抗 凋 亡 能 力 相 对 应 的 是 ，IAPs 家族成员在人类大部分肿瘤中是高表达 的， 而在正常组织和分化终末组织中低 表达。 肿瘤细胞对传统治疗的耐受也与 过 量 表 达 IAPs 蛋 白 有 关 。 IAPs 蛋 白 对 caspases 的 抑 制 受 到 线 粒 体 蛋 白 Smac 的 负 性 调 控 。 Smac 通 过 N 端 4 个 氨 基 酸 残 基 和 IAPs 结 合 ，阻 止 IAPs 对 caspases 的 抑 制 。 在 以 IAPs 为 靶 向 的 治 疗 策 略 中 ， 用 Smac 衍 生 的 肽 段 ，N 端 包 含 4 个 氨 基 酸 识 别 残 基 ，可 以 很 好 地 抑 制 IAPs 的 活 性 ［21－22］。 3．3 SCF 复 合 物 SCF 复 合 物 包 含 Skp1、Cullins、F-box 蛋 白 、ROC ／ Rbx ／ SAG 环 指 蛋 白 ， 其 中 Cullins 的 作 用 是 为 复 合 物各个组分提供作用平台， 环指蛋白识 别 E2，Skp1-F-box 识 别 底 物 。 通 过 不 同 的 F-box 蛋 白 ， 介 导 不 同 底 物 的 降 解 。 SCF 复 合 物 的 组 分 发 现 在 许 多 肿 瘤 中 高 表 达 ［23－25］。 4 展望
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园艺学报 2014，41（8）：1689–1698 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2 finger基因的克隆与表达分析金晓琴，康振，刘伟娜，潘永娟，王梨嬛，郭卫东，杨 莉*（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004）摘 要：在26S泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解过程中，RING finger蛋白是一类特殊的泛素蛋白连接酶，参与植物多个生长发育及逆境胁迫响应过程。
为探明柚RING finger家族成员的序列特征及表达模式，从红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实汁胞中分离出两个RING finger基因cDNA片段（CgRHF1和CgRHF2），采用实时荧光定量PCR研究其在不同组织及果实发育不同时期的表达模式。
结果表明，两个基因均属于RING-H2 finger家族成员，且红肉蜜柚与琯溪蜜柚的两个CgRHF之间碱基序列均无差异；除根组织外，CgRHF1表达水平较CgRHF2高，且在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达水平显著高于琯溪蜜柚；CgRHF2在组织及果实发育过程表达水平均较低，但在果实成熟采摘阶段急剧上升。
CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能，而非功能互补基因。
关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；RING-H2 finger基因；克隆；基因表达中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1689-10 Isolation and Expression Analysis of Two Ubiquitin-protein Ligase RING-H2 Finger Genes from Pommelos[Citrus grandis（L.）Osbeck]JIN Xiao-qin，KANG Zhen，LIU Wei-na，PAN Y ong-juan，W ANG Li-huan，GUO Wei-dong，and Y ANG Li*（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004，China）Abstract：RING（Real Interesting New Gene）finger proteins specify the substrates in the 26S ubiquitin-proteasome pathway，and play important roles in plant development and stress responses. However，the sequences，expression characteristics and physiological functions of RING finger genes in pommelo are little known. In this study，two RING finger（CgRHF1 and CgRHF2）cDNA fragments were isolated from Red-fleshed and Guanxi pommelo. The results showed that two CgRHFs were belonged to RING-H2 finger subfamilies，and there is no DNA base difference in the sequences of two cultivars. Quantitative real-time PCR results showed that gene expression of CgRHF1 is significantly higher than CgRHF2，especially in the stems，leaves and flowers of red-fleshed pommelo. The expression levels of CgRHF2 were relatively low in the tissues and fruit development of two pommelo cultivars，but dramatically increased at the fruit mature stage. This study has implied that CgRHF1 and CgRHF2 may play different roles in the tissues and fruit development of Red-fleshed and Guanxi pommelo，and can not functionally complement.收稿日期：2014–03–04；修回日期：2014–07–22基金项目：国家自然科学基金项目（30900978）；浙江省自然科学基金项目（LY14C150001）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：yangli@）1690 园艺学报41卷 Key words：red-fleshed pommelo；Guanxi pommelo；RING-H2 finger gene；clone；gene expression26S泛素蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway）是已知真核生物中主要的蛋白质降解途径，通过调节功能蛋白周转和降解异常蛋白，实现对多种代谢过程的调节，在细胞周期、信号转导、细胞分裂与分化、胁迫反应和细胞程序性死亡等细胞生理活动中起重要作用（Frescas & Pagano，2008；Bedford et al.，2009；Hochstrasser，2009；Navon & Ciechanover，2009）。
泛素蛋白酶体途径的具体过程是：由ATP提供能量，泛素激活酶（ubiquitin-activating enzymes，E1）激活泛素，并将泛素转移至泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2）的活性位点半胱氨酸（Cys），形成E2–泛素复合物；泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases，E3）能识别靶蛋白，将E2和靶蛋白在空间上拉近，促进E2将泛素转移至靶蛋白，或是E2将泛素转移至E3，由E3转移泛素至靶蛋白。
当靶蛋白泛素化水平达到一定程度后，转运至26S蛋白酶体进行降解（Moon et al.，2004；Li et al.，2011；Wang & Deng，2011）。
26S泛素蛋白酶体途径是目前已知的具有高度选择性的蛋白质降解途径，是生命过程进行精确时空调控的重要方式（Hochstrasser，2009），拟南芥中约有5%的蛋白质参与该途径（Stone et al.，2005）。
26S蛋白酶体主要存在于细胞质与细胞核，识别泛素化的蛋白并将其降解是一非特异性的过程。
因此E3连接酶在此过程中发挥了至关重要的作用，决定反应的特异性。
在泛素介导的选择性蛋白降解途径中，E3连接酶是识别靶蛋白N端不稳定氨基酸信号的关键酶（宋素胜和谢道昕，2006；Budhidarmo et al.，2012）。
目前发现的E3连接酶主要有HECT（homologous to E6-AP carboxy terminus）结构域家族、RING（Real Interesting New Gene）finger结构域家族和U-box（Ubiquitin chain elongation factor）结构域家族3大类。
其中RING结构域家族是一个庞大的蛋白家族，其环指结构域（RING finger domain）是RING finger类蛋白具有E3连接酶功能的重要结构。
标准的RING finger蛋白包含1个至多个特定位置的Cys和组氨酸（His）残基组成的锌指结构域，由两个Zn2+和相应的氨基酸残基形成“cross-brace”结构，将E2和靶蛋白拉近，从而使E2–泛素复合物上的泛素高效地转移至靶蛋白（Lecker et al.，2006；Metzger et al.，2012）。
根据Zn2+结合残基Cys和His的数量与位置不同，RING finger家族又可分为RING-HC、RING-H2、RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T、RING-G、RING-mH2和RING-mHC 9大亚类（Li et al.，2011）。
现有研究表明，RING finger蛋白家族成员独立或以多亚基复合体的形式在光形态建成、激素反应、生理节奏、胁迫反应、种子粘液、木质化以及花的发育等过程中起到十分重要的作用（Osterlund et al.，2000；Ma et al.，2002；Molnar et al.，2002；Xu & Li，2003；Guo & Ecker，2004；Moon et al.，2004；Seo et al.，2004；Kepinski & Leyser，2005；Serrano et al.，2006；刘辉志和韩世平，2010；李彦泽，2011；Wang & Deng，2011）。
Welsch 等（2007）发现包含RING finger结构域的SINAT2（SEVEN in ABSENTIA of Arabidopsis2），可能与转录因子AtRAP2.2共同调控拟南芥类胡萝卜素含量，是否存在其他E3连接酶参与调控植物类胡萝卜素的生物合成与代谢尚不清楚。
此外，本实验室前期基因芯片分析发现一个RING-H2 finger基因在琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚中的表达具有较大差异。
作者从两种蜜柚中分别分离出两个RING-H2 finger基因，研究其在不同组织及果实不同发育时期的表达规律，为进一步研究该基因在特异靶蛋白选择性降解过程中的作用，以及红肉蜜柚果实变异的分子机制提供基础。
1 材料与方法1.1试验材料供试材料为福建省平和县小溪镇锦盛公司育种基地的10年生琯溪蜜柚及其红肉早熟突变体红8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2 finger基因的克隆与表达分析 1691肉蜜柚。
于2012年4月采集幼嫩的须根，春梢（茎），完全伸展的叶片，盛花期的全花，以及盛花期后75、105、135、165和195 d的果实汁胞，样品用液氮速冻后于–80 ℃贮存备用。