人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有 １０ ｎｇ／ｍＬ 的 ＶＥＧＦ 的培养基中培养， 观察细胞的生长及传代。并在倒
置显微镜下观察细胞的形态学特点， 同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周
期。结果 两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞， 胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶， 且比
较理想的消化时间均为 １３ ｍｉｎ， 细胞接种后 ４～５ ｈ 开始贴壁生长， １ 周左右可生长成单层， 光镜下呈多角形 ， “铺
路石”样排列， 免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有 ５０．６％
的细胞处于 Ｇ０／Ｇ１ 期。结论 胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可 取方法， 而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液， 成功率高， 可靠性大， 可成功构建体外研究血管内皮
ＱＩＮ Ｍｉｎｇ－ ｃｈｕｎ， ＷＡＮＧ Ｒｕｏ－ ｇｕａｎｇ， ＱＩＮ Ｌｉ－ ｈｕａ， ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ ｌｉ， ＬＩ Ｃｈｕｎ－ ｍｅｉ， ＬＩＵ Ｈｕｉ－ ｐｉｎｇ， ＹＥ Ｚａｎ
（ＴＣＭ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｎａｎ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， Ｈｕｎａｎ ４１０００７， Ｃｈｉｎａ）
〔收稿日期〕２００６－ １２－ ２６ 〔基金项目〕国家自然科学基金（ ３０４７２２２７， ３００００２２５） 。 〔作者简介〕秦明春（ １９７９－ ） ， 男， 硕士， 主要从事妊娠病临床及基础研究工作。 〔通讯作者〕＊ 王若光， 男， 教授， 博士后， Ｔｅｌ： ０７３１－ ５３８１２９２。
第４期
〔Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ〕ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ； ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ； ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞， 通 过产生和分泌许多血管活性物质， 在维持血管舒缩、 抗凝血及血管构建等方面起重要作用， 同时由于其 特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、 压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化， 通 过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互 联系， 对各种刺激作出反应， 维持机体内外环境的稳 定。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与 多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带由于取材方 便， 来源充足， 而成为血管内皮细胞体外实验的主要 材料。本文利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐 带， 采用改进的灌注消化法， 运用不同的消化酶成功 分离了人脐静脉内皮细胞， 并用免疫组织化学法进 行了鉴定， 从而为构建体外研究血管内皮细胞的模 型及进一步实验研究打下了基础。
秦明春， 等 人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
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ｇｅｎｅｎａｓｅⅡ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅠｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇａｉｎ ＥＣｓ， ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｅｎａｓｅ ｉｓ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｆｌｕｉｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｈｏｉｃｅ， ａｎｄ ｃａｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＥＣｓ．
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湖南中医药大学学报
２００７ 年第 ２７ 卷
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 标本来源与采集 标本均来自于湖南中医药 大学第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生 儿脐带。于无菌条件下剪下脐带（ 至少 ２０ ｃｍ） 放入 装有培养基的无菌容器中， 快速移入实验室， １ ｈ 内 行脐静脉内皮细胞的分离培养。 １．１．２ 试剂 ＰＲＭＩ－ １６４０ 培养基、类标准胎牛血清 （ Ｈｙｃｌｏｎｅ）； Ｌ－ 谷氨酰胺（ Ｓｉｇｍａ 公司） ； ＶＥＧＦ（ Ｓｉｇｍａ 公 司） ； 胰蛋白酶（ Ａｍｒｅｓｃｏ 公司） ； 胶原酶Ⅰ、Ⅱ（ Ｇｉｂｃｏ 公司） ； 兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试 剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）； 青－ 链霉素 （ Ｇｉｂｃｏ 公司） ； 其它试剂均为国产分析纯。 １．１．３ 仪器 水套式 ＣＯ２ 培养箱 （ ２３００ 型， ＳＨＥＬ－ ＬＡＢ） ； 超 净 工 作 台 （ ＳＷ－ ＣＪ－ ＩＦ， 苏 州 安 泰 空 气 技 术 公 司 ） ； 台 式 多 管 自 动 平 衡 离 心 机 （ ＴＤＺ５－ ＷＳ， 长 沙 平凡仪器仪表有限公司） ； 倒置显微镜（ ＸＤ－ １０１ 型， 南京江南光电股份有限公司） ； 制冰机（ ＡＦ１００ 型， 斯 科茨曼公司） ； 超纯水仪 （ Ｍａｘｉｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＥＬＧＡ 公司） ； 电热重蒸水器 （ ＺＬＳＣ， 上海申安医疗器械 厂） ； 座式自控电热压力蒸气灭菌器（ＺＤＸ－ ３５ 型， 上
〔摘要〕目的 探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法， 提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管
内皮细胞培养模型， 为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法 取 ２ 根脐带（ 至少 ２０ ｃｍ） 冲净淤血， 采用加工
穿刺针固定脐静脉灌注消化液， 一根用 ０．２％胶原酶Ⅱ， 另一根用 ０．１％胶原酶Ⅰ和 ０．２５％胰酶等比混合消化液，
细胞的模型。
〔关 键 词 〕人脐静脉内皮细胞； 细胞培养； 流式细胞术； 细胞周期； 分离； 鉴定
〔中 图 分 类 号 〕Ｒ４５８．８
〔文 献 标 识 码 〕Ａ
〔文章编号〕１０００－ ５６３３（２００７）０４－ ００１２ｉｎ ｖｉｔｒ ｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒ ｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ
１２ ·基础研究·
湖南中医药大学学报 Ｊ ｏｕｒ ｎａｌ ｏｆ ＴＣＭ Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｈｕｎａｎ
２００７ 年 ８ 月第 ２７ 卷第 ４ 期 Ａｕｇ． ２００７ Ｖｏｌ． ２７ Ｎｏ． ４
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
秦明春 １， 王若光 ２＊， 秦莉花 １， 刘小丽 １， 李春梅 ２， 刘惠萍 １， 叶 赞 １ （ １．湖南中医药大学 ２００４ 级硕士研究生班， 湖南 长沙 ４１０００７； ２．湖南中医药大学中西医结合学院， 湖南 长沙 ４１０００７）
〔Ａｂｓｔｒ ａｃｔ〕Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅ－ ｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＥＣｓ） ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ， ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ＥＣｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ＥＣｓ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅ－ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＥＣｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｓ， ２０ ｃｍ ｌｏｎｇ， ｗｅｒｅ ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｆｉｌｌｅｄ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｆｌｕｉｄｓ， ０．２％ ｃｏｌｌａｇｅｎｅｎａｓｅ Ⅱ ｉｎ ｏｎｅ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ０．１％ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅠｉｎ ａｎ ｏｔｈｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ａｌｌ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｗｉｔｈ １０ ｍｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ， ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｃｒｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ， ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＥＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｍｉ－ ｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｕｎｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｅｎｏｕｇｈ ＥＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｔｈ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄｓ， ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅ－ ｎｅｎａｓｅ Ⅱ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ １３ ｍｉｎｕｔｅｓ． ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｇｒｅｗ ｏｎ ｔｈｅ ｗａｌｌ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｆｔｅｒ ４－ ５ ｈｏｕｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｏｒｍｅｄ ａｆｔｅｒ ｏｎｅ ｗｅｅｋ． Ⅷ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ＥＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ５０．６％ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ａｔ ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｇ０／Ｇ１． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌａ－
海申安医疗器械厂）； 电子分析天平（ ＡＢ２０４Ｎ 型， 梅 特 勒 － 托 力 多 有 限 公 司 ） ； 流 式 细 胞 仪 （ ＢＥＣＴＯＮ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） 。 １．２ 方法 １．２．１ 人脐静脉内皮细胞的原代分离及培养 将取 来的脐带迅速移入洁净操作台内， 无菌条件下将其 放入提前盛有预热 ＰＢＳ 培养皿中， 剪去有钳夹痕及 血肿的部分， 挤出脐带中的血， 用剪刀修齐两断面， 分成 ２０ ｃｍ 的一段。找出脐静脉（ ２ 根管腔较细的是 脐动脉， １ 根管腔较粗的是脐静脉） ， 用带平针头的 注射器从一端插入脐静脉， 血管钳固定， 再用预热的 ＰＢＳ 冲洗 ３ 次以上， 将血迹完全冲洗干净。为防止脐 动脉残留的血液混入， 可将动脉分离少许用消毒线 结扎， 用止血钳钳夹另一端。从冲洗的针头中注入 ０．１％胶原酶Ⅱ使其充盈， 另一条以同样的方法注入 ０．１％胶原酶Ⅰ和 ０．２５％胰酶等比混合消化液。取出 针头， 用止血钳夹住注入端， 移入无菌烧杯中， 置于 ３７ ℃培养箱中孵育 １３ ｍｉｎ。取出， 松开注入端的血 管 钳 ， 收 集 脐 静 脉 内 的 消 化 液 ， 然 后 注 入 含 １０％胎 牛血清的 ＲＰＭＩ－ １６４０ 培养液再次冲洗管腔， 将消化 液与冲洗液一并收集于离心管， １ ０００ ｒ／ｍｉｎ， 离心 ５ ｍｉｎ， 弃上清， 加入 ＲＰＭＩ－ １６４０ 完全培养液 （ 含 ２０％ 胎牛血清， １０ ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ。Ｌ－ 谷氨酰胺 ２ ｍｍｏＬ／Ｌ， 青 霉 素 １００ Ｕ／ｍＬ，链 霉 素 １００ ｍｇ／ｍＬ） ，用 巴 氏 吸 管 轻轻吹打均匀， 按 １×１０６ 个接种于培养瓶， 置于 ５％ ＣＯ２， ３７ ℃培 养 箱 中 培 养 ， ２４ ｈ 后 更 换 培 养 液 去 除 未贴壁的细胞， 然后每隔 ２４ ｈ 半定量换液 １ 次至细 胞生长铺满瓶底。 １．２．２ 人脐静脉内皮细胞的传代培养 待细胞生长 融合成单层细胞后， 弃去培养液， 加入 ０．１２５％胰 蛋 白酶／０．０２％ ＥＤＴＡ 混合消化液 ２～３ ｍＬ， 倒置显微 镜下观察， 当细胞回缩变圆后弃去消化液， 加入 ＲＰ－ ＭＩ－ １６４０ 完全培养液 ５～１０ ｍＬ 终止消化， 用巴氏吸 管吹打制成细胞悬液， 按 １∶２ 或 １∶３ 比例将细胞悬液 接种于培养瓶中， 置于培养箱中培养。 １．２．３ 人脐静脉内皮细胞的形态学观察及鉴定 细 胞换液后直接在倒置显微镜下观察细胞的形态及生