SV40T转化人脐静脉内皮细胞贴壁培养
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
人脐静脉内皮细胞体外培养及其相关研究
医学综述 2010 年 2月第 16 卷第 3期 M edical R ecapitu late , Feb 2010 , V o. l 16, N o . 3 287 294. M ik i T, S trom SC. Am n ion derived p lu ripotent /mu lt ipotent stem cells[ J]. S tem C ell R ev, 2006 , 2 ( 2) : 133 142 . Tam agaw a T, Ish iwata I , Saito S. E stab lishm ent and characterization of a p luripoten t stem cell lin e derived from hum an am n iotic m em b ranes and in itiat ion of ger m layers in vitro[ J] . Hum Cel, l 2004 , 17( 3) : 125 130. Saku ragaw a N, Thangavel R, M izugu chi M , et al. Exp ression of m arkers for both n euron al and glial cells in hum an amn iot ic ep ith e lial cells[ J] . N eu rosci Let t , 1996 , 209 ( 1) : 9 12 . Saku ragaw a N, M isaw aH, O h sug iK, e t al. Ev idence for act ive ace ty lchol ine m etabol ism in hum an am n iot ic ep ithelial cells : A ppl ica b le to intracereb ral allograft ing for neuro log ic d isease[ J] . N eu rosci Lett , 1997 , 232 ( 1) : 53 56 . El w an M A, Saku ragaw a N. Ev idence for synthes is and release of catecholam in es by hum an amn iot ic ep ithelial cells [ J ] . N eurore port , 1997 , 8( 16) : 3435 3438 . El w an M A, Thangavel R, O no F, et al. Syn thesis and release of catecholam in es by cu ltu red monk ey am n iotic epithelial cells[ J] . J N eurosci R es , 1998 , 53( 1 ) : 107 113 . K ak ish ita K, E l w an M A, N akao N, et a l . Hu m an amn iotic epithelial cells produce dopam ine and survive after m i p lan tation in to the striatum of a rat model of Park inson s disease : A potent ial source of donor for tran sp lantation th erapy[ J] . Exp N eu ro, l 2000 , 165 ( 1) : 27 34 . K ak ish ita K, N akao N, S akuragaw a N, e t al. I m p lan tat ion of human amn iot ic ep ithelial cell p reven ts the degeneration of n igral dopa m ine neu rons in rats w ith 6 hyd roxydopam ine les ion s [ J] . B rain R es , 2003, 980( 1) : 48 56. Saku ragaw a N, Enosaw a S, Ish ii T, et al. H um an amn iot ic ep ith elial cells are p rom is ing t ransgen e carriers for allogen eic cell tran sp lan tat ion in to l iver[ J] . J H um G enet , 2000 , 45( 3 ): 171 176 . Takash i ma S , IseH, Zh ao P, et al. H um an am n iotic ep ith elial cells possess hep atocyte like characteristics and functions [ J ] . C ell S truct Fun ct , 2004, 29( 3) : 73 84. D avila JC, C ezar G G, Th ied eM, e t a l . U se and app lication of stem cells in tox icology[ J] . Toxicol Sc, i 2004 , 79( 2 ): 214 223 . W ei JP, Zhang TS , K aw a S, et a l . Hum an amn ion isolated cells nor m alize b lood glucose in s treptozotocin indu ced d iabetic m ice [ J] . Cel l Transplant , 2003 , 12 ( 5) : 545 552 . Port m ann Lanz CB , Schoeberlein A, H uber A, et a l . P lacen tal m es enchym al s tem cells as potent ial au tologous graft for pre and per i natal neu roregeneration[ J] . Am J O bstet G yneco, l 2006 , 194( 3) : 664 673. [ 21]
人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定
physiology and the role of novel risk factors:a
静脉通道，遇到病情变化可随时用药，为抢救患者生命
2 方法
赢得了宝贵的时间。
2.1 材料选用 套管针采用洁瑞公司生产的封闭式套 3.3 套管针的穿刺部位均为静脉远端，近邻无重要脏
管针，型号为２０Ｇ或２２Ｇ；敷料采用３Ｌ公司９ｃｍ×６ｃｍ的无 器组织，从而避免了深静脉穿刺的并发症。
菌透明敷贴。
4 使用套管针的注意事项
静脉套管针作为一项新的护理技术已广泛应用于 套管，放松止血带，拔出针芯，用无菌透明敷贴固定套管
临床，特别在急危患者的抢救中更为重要，它保持了静 针，调节输液速度。
脉管道的持续畅通。在Ｃ Ｃ Ｕ 的工作中常常遇到以下情 3 使用套管针的优越性
况：急性心肌梗死的患者由于剧烈的胸痛和恶心呕吐导 3.1 套管针针体长，外套管柔软远端圆滑而整齐，留
1 临床资料
体外渗的发生，对急性心肌梗死的患者静脉具有保护作
我院自２００８．１－２００９．４应用静脉套管针技术抢救急 用，套管针可以留置５－７ｄ［２］。对于需要反复多次静脉输液
性心肌梗死患者１００例，其中男６８例，女３２例；年龄２９－８６ 及随时需要输液的患者，套管针的留置等于一条开放的
岁，平均６ ７ ． ４ 岁。
·６０·
承 德 医 学 院 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＥＮＧＤＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。
）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。
9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。
2000转/分，离心3分钟。
12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会
人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会杜利君;蒋兴亮【摘要】目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法.方法:采用0.1％ IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20％胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原.结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列.免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础.【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养【作者】杜利君;蒋兴亮【作者单位】川北医学院附属医院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】R329.2体外建立人血管内皮细胞模型是研究人体大血管内皮功能的主要手段之一。
由于内皮细胞株ECV304在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞比较存在明显差异［1］，因此，体外分离和原代培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)已成为国内外学者获取内皮细胞的重要途径。
本实验在借鉴其他学者体外分离、培养HUVECs技术的基础上，通过大量的实验并对此加以改良，旨在建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的HUVECs的分离、培养方法，为进一步研究血管内皮细胞的功能及阐明相关疾病的生理和病理机制奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料M199培养液和胎牛血清分别为Invitrogen公司和Hyclone公司产品，IV型胶原酶、内皮细胞生长因子(ECGS)、肝素钠均为Sigma公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔IgG抗体为北京中杉金桥公司产品，青霉素和链霉素为华北制药股份有限公司产品。
人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定
ｓｎ ｔ １ ．Ｄｅａｔ ｎ ａｄｏ ｇ ，Ｔ ｅ ６ ｏ ｉ ｌｆＰ Ａ ｈｎ ｄ ｅｅ０ ７０ Ｃ ｉ ２ ｅｔ ｌ ｔｉ ｕｐｙＤｅａ ｍ ｎ，Ｔ ｅ ｏｇ ，ｅａ．１ ｐ ｒ ｔｆＣ ｒｉｏｙ ｈ ６Ｈ ｓ ｔ Ｌ ，Ｃ ｅｇ ｅ ｂｉ ６ ００， ｈｎ ｍｅ ｏ ｌ ２ ｐａ ｏ Ｈ ａ； ．Ｃｎｒ ｅｌ Ｓｐｌ ｐ ｒ ｅｔ ｈ ａ Ｃ ｒｅ ｔ Ａｆａｅ ｏ ｉ ｌ Ｃ ｅｇ ｅ ｄ ａ ｏ ｅｅ Ｃ ｅｇ ｅ ｅｅ０ ７ ０ ， ｈｎ ；．Ｄｐ ｒ ｅｔｆＣ ｒｉｏｙ Ｓｃｎ Ｈ ｓｉ ｌｆＴａｆ ｆ ｌｔ ｉ ｄＨ ｓ ｔ ｏ ｈｎ ｄ Ｍｅｉ ｌ ｌｇ ， ｈｎ ｄ Ｈ ｂｉ ６ ０ ０ Ｃ ｉ ３ ｅａ ｍ ｎ ａｄｏ ｇ ， ｅｏ ｐ ａｆ ｃ Ｃｌ ａ ｔ ｏ ｌ ｄ ｏ ｔ ｉｉ ｐ ａｏ ｎ ｎＭｅｉ ｌ － ｄｃ ａＵ
Ｐ Ｙ．ａ ｄｔｅｅ ａ ｎ ｔ ｎｗｉ ｎｉｅ ｓｏ ｕ ｎ Ⅷ ｆｃｏ ｓｐ ｓ ｉｅ ｎ ｈ ｘ ｍｉａｉ ｔ ａ ｔ ｎ ｆｈ ｍａ ｏ ｈ ｇ ａｔｒｗａ ｏ ｉｖ ．Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐｅｆ ｓｏ ｔ ｐｅＩ ｏｌｇｎ ｓ ｎｅｆｃｉｅｗａ ｏｃｌｅｔ ｔ ｎ ｌｓｏ ｒｕ ｉｎｗｉ ｔ ｌ ｅ ａ ｅｉ ａ ｆｅ ｔ ｙｔ ｏｌｃ ｈｙ ｃ ａ ｓ ｖ
ＪｕｎｌｆＣｉｉ ｌ ｎ ｘｅｍｅｔｌ ｄｃ ｅＶ１１ ， ｏ １ Ｓｐ ２ １ ｏ ｒａ ｌ ｃ ｄＥ ｐｒ ｎａ ｉｎ ｏ． １ Ｎ ． ８ ｅ．０ ２ ｏ ｎａａ ｉ Ｍｅ ｉ
人 脐 静 脉 内皮胞 细体 外 培 养及 鉴 定
李 东升 邵 素玲 杨 万松 黄 体钢 １解放 军 ２ ６医院心 内科 河 北 承德 （ ６ ２承德 医学 院附属 医院 消毒 供应 中心 河 北 ３天 医科 大 学第二 医院心脏 科 天津 承德 ０７０ ６００； ３０ １ ） ０２ １
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。
建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。
方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液，一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。
收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。
并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。
用流式细胞术观察细胞周期。
结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。
细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。
结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。
【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。
内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。
新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。
原代人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进与鉴定
原代人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进与鉴定摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞（HUVECs）原代培养的方法，为体外研究血管内皮细胞功能提供实验基础。
方法取健康剖宫产新生儿脐带15-20cm，2h内用0.1%II型胶原酶37℃孵育12min得细胞，用改良M199培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞形态特点，免疫组织化学染色进行细胞鉴定，管腔形成实验观察细胞传代后小管形成能力变化。
结果采用0.1%II型胶原酶灌注法及改良培养基可相当数量、细胞形态良好的HUVECs，利用Ⅷ因子相关抗原进行鉴定得到纯度大于99%，且传代后管腔形成能力与原代细胞无差别（P<0.05）。
结论用0.1%II型胶原酶分离方法和改良的M199培养基可得到数量多、形态好、功能稳定的人脐静脉内皮细胞，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。
【关键词】人脐静脉内皮细胞细胞培养分离鉴定【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）28-0017-02内皮细胞功能紊乱参与了动脉粥样硬化、高血压、糖尿病微血管病变等多种心血管疾病复杂的病理机制中，因此研究血管内皮细胞的功能变化成为了研究心血管疾病的重要方向[1]。
体外成功建立内皮细胞模型依赖于获取高质量的内皮细胞，人脐静脉为内皮细胞的主要来源，其具有取材方便，来源较充足和操作简易等特点，但其分离结果受较多因素的影响[2]。
本实验组通过不断摸索，采用II型胶原酶灌注法和改良M199培养液可获得数量较多、细胞纯度高、活性良好的内皮细胞。
1 材料与方法1.1标本来源标本均来自某三甲医院足月健康剖腹产婴儿脐带组织（产妇及其家属签署知情同意书）。
1.2试剂与仪器 M199培养基（Gibco），内皮生长因子（ScienCell)，胎牛血清（Hyclone），Ⅱ型胶原酶（Sigma-Aldric），Matrigel胶（BD），Ⅷ因子相关抗原（武汉博士德），倒置显微镜（日本Olympus）。
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北京索莱宝科技有限公司
SV40T转化人脐静脉内皮细胞贴壁培养
细胞名称：SV40T转化人脐静脉内皮细胞；PUMC-HUVEC-T1
形态特性：上皮样
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H，10%FBS。
传代方法：1:3-4传代。
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
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